diciembre 16, 2022
Resumen
Los altos niveles de crioprotectores penetrantes (CPA) pueden eliminar la formación de hielo durante la crioconservación de células, tejidos y órganos a temperaturas criogénicas. Pero los CPA se vuelven cada vez más tóxicos a medida que aumenta la concentración. Se han intentado muchas estrategias para superar el problema de eliminar el hielo mientras se minimiza la toxicidad, como intentar optimizar las velocidades de enfriamiento y calentamiento, o intentar optimizar el tiempo de adición de CPA individuales durante el enfriamiento. Debido a que las estrategias utilizadas actualmente no son adecuadas, la toxicidad de CPA sigue siendo el mayor obstáculo para la criopreservación. La toxicidad del CPA se interpone en el camino de la criopreservación criogénica de órganos humanos, un procedimiento que tiene el potencial de salvar muchas vidas. Esta revisión intenta describir lo que se sabe sobre la toxicidad de CPA, las teorías de la toxicidad de CPA y las estrategias para reducir la toxicidad de CPA.
Introducción
La disponibilidad de órganos trasplantables podría posponer considerablemente el 30% de todas las muertes en los Estados Unidos. Pero la demanda de órganos trasplantables supera con creces la oferta. La crioconservación reversible de órganos trasplantables a temperaturas criogénicas podría aumentar sustancialmente su disponibilidad. 1
Los agentes crioprotectores (CPA) se utilizan para eliminar la formación de hielo cuando se enfrían los órganos a temperaturas criogénicas. 2 Los órganos podrían criopreservarse sin formación de hielo si no hubiera un límite en la cantidad de CPA que se podría usar, pero la toxicidad de los CPA limita la cantidad que se puede usar. 3 La toxicidad del CPA se ha descrito como el principal impedimento para la crioconservación por vitrificación. 2 , 4 Comprender los mecanismos de toxicidad de CPA para saber cómo reducir la toxicidad de CPA podría ser el medio para lograr una criopreservación de órganos exitosa.
Esta revisión intentará presentar una descripción general de la toxicidad de CPA en el nivel más amplio posible. Muchos investigadores de criopreservación, si no la mayoría, parecen tener la opinión de que la toxicidad del CPA sigue reglas diferentes para diferentes células, tejidos u organismos. 5Sin embargo, todas las células, tejidos y organismos están compuestos de componentes celulares y macromoléculas similares. Comprender las razones de las diferentes toxicidades en diferentes entornos biológicos puede llevar a comprender los mecanismos de la toxicidad de la CPA. Si los eritrocitos o embriones de una especie muestran toxicidades de CPA muy diferentes a las de los eritrocitos o embriones de otra especie, comprender las razones de esas diferencias debería proporcionar información sobre los mecanismos de toxicidad. Esta revisión no pretende explicar las muchas diferencias desconcertantes observadas en la crioconservación de diferentes sistemas biológicos con diferentes CPA, sino que intenta presentar los resultados vistos empíricamente con la esperanza de servir como un impulso para que otros descubran explicaciones.
Muchas de las diferencias en los resultados de la investigación de toxicidad de CPA surgen debido a diferentes condiciones experimentales, como temperatura, concentración de CPA, tiempo de exposición de CPA, solución portadora de CPA y tipo de ensayos de toxicidad (ensayo de viabilidad). Los CPA pueden considerarse tóxicos si las membranas celulares se rompen o se dañan, si la función enzimática se ve afectada, si se reduce el desarrollo de células o embriones, si la motilidad de los espermatozoides se ve afectada, si se reduce la función mitocondrial o si se daña el ADN, las proteínas u otras macromoléculas. . Algunos efectos que se consideran debidos a la toxicidad del CPA pueden deberse en realidad a un choque osmótico, estrés oxidativo, daño por frío u otras causas de daño.
La toxicidad puede ser específica de un CPA particular (toxicidad específica) o toxicidad que es consecuencia de ser un CPA (toxicidad no específica). 6–8 Se cree que los CPA previenen la formación de hielo al interferir con los enlaces de hidrógeno entre las moléculas de agua, 9 y se ha propuesto que este efecto causa toxicidad no específica. 8
El enfoque de esta revisión estará en los CPA ampliamente utilizados que atraviesan las membranas celulares ("CPA penetrantes"), a saber, etilenglicol (EG), propilenglicol (PG; 1,2-propanodiol), dimetilsulfóxido (DMSO), glicerol (GLY ), formamida (FMD), metanol (METH) y butanodiol (BD; 2,3-butanodiol). La revisión comienza con una descripción de toxicidades específicas de CPA y formas específicas de daño. A continuación se presentan algunos estudios comparativos de CPA. Las secciones finales tratan sobre las teorías de la toxicidad de la CPA o las estrategias para lograr la neutralización de la toxicidad de la CPA.
Toxicidades específicas de CPA
Aunque algunas de las toxicidades específicas de CPA discutidas solo ocurren a altas temperaturas o en células u órganos particulares, es posible que el conocimiento de estos efectos pueda arrojar luz sobre las lesiones asociadas con estos CPA durante su uso para la crioconservación.
El EG es metabolizado (principalmente en el hígado) por la alcohol deshidrogenasa a glicoaldehído y luego por la aldehído deshidrogenasa para producir ácido glicólico, lo que puede resultar en acidosis metabólica. El ácido glicólico se puede metabolizar aún más a ácido oxálico, que se precipita con el calcio para formar cristales de oxalato de calcio en muchos tejidos, especialmente en el riñón. 10-13 El metabolismo de EG hasta el punto de provocar síntomas clínicamente significativos puede tardar horas a la temperatura corporal. Debido al tiempo requerido y a que el metabolismo ocurre principalmente en el hígado, esta forma de toxicidad probablemente no sea relevante para los procedimientos hipotérmicos rápidos que se usan para criopreservar órganos, tejidos y células. Independientemente de los efectos del oxalato de calcio, el EG puede causar irritación gastrointestinal y edema pulmonar 14así como la inflamación generalizada de los pulmones. 15
PG tiene pocos efectos tóxicos sistémicos como lo demuestra el hecho de que se ha utilizado de forma segura en muchos productos alimenticios. El PG se ha utilizado como antídoto para el envenenamiento por EG. 16 No obstante, el PG a menudo presenta toxicidad cuando se usa como CPA. Por ejemplo, se ha demostrado que PG en exceso de 2,5 M afecta el potencial de desarrollo de los cigotos de ratón al disminuir el pH intracelular. 17
La crioconservación de espermatozoides por GLY fue un gran avance para la criobiología. 18 Sin embargo, algunas lesiones son evidentes. 19 Sistémicamente, 10 ml de GLY al 50 % por kilogramo induce insuficiencia renal en ratas a través de la inflamación, el estrés oxidativo y la apoptosis. 20 Todos estos procesos son facilitados por las caspasas. 21 GLY agota el glutatión reducido en el riñón, lo que provoca estrés oxidativo. 22 En espermatozoides sementales, GLY en concentraciones superiores al 1,5% polimeriza el citoesqueleto de actina, un fenómeno no relacionado con la osmolalidad. 23La congelación de esperma humano con un 15 % de GLY tiene la misma probabilidad de dañar la morfología, las mitocondrias y la viabilidad del esperma, pero se demostró que la reducción de la motilidad se correlaciona con la reducción de la función mitocondrial. 24 Según los informes, GLY es mucho más tóxico que otros CPA para los embriones de platija 25 y la bacteria Escherichia coli . 26
FMD es una amida altamente corrosiva que se ha utilizado para fabricar plásticos. La inhalación de grandes cantidades de fiebre aftosa puede requerir atención médica debido a la lesión de los riñones y las células sanguíneas, 27 aunque los mecanismos moleculares no se han estudiado detenidamente. Al igual que con el agua, las moléculas de FMD pueden formar cuatro enlaces de hidrógeno intermoleculares y, por lo tanto, la solución pura de FMD formará redes como lo hace el agua. 28 El momento dipolar de la molécula de FMD es aproximadamente el doble que el de una molécula de agua. 29 Los enlaces de hidrógeno de la FMD con el agua son entre un 10 y un 20 % más fuertes que los enlaces de hidrógeno entre las moléculas de agua. 30 , 31Mezcladas con agua, las moléculas de FMD se asocian más fuertemente que con las moléculas de agua, lo que puede explicar por qué la FMD no puede vitrificarse en una solución acuosa sin la ayuda de otros CPA. 4 Una molécula de FMD forma enlaces de hidrógeno con otra molécula de FMD con una fuerza de −5,51 kcal/mol, pero una cadena de 12 moléculas de FMD puede alcanzar una fuerza de enlace de hidrógeno de −13,66 kcal/mol. 32 Estas fuerzas de los enlaces de hidrógeno son mayores que la fuerza de los enlaces de hidrógeno entre las moléculas de agua (−4,46 kcal/mol). 33 La fiebre aftosa puede desnaturalizar el ADN, un efecto que se cree que se debe al desplazamiento del agua hidratante. 30
La METH se metaboliza a formaldehído y luego a ácido fórmico por la alcohol deshidrogenasa, 34 que puede causar acidosis metabólica, inestabilidad cardiovascular y ceguera por destrucción del nervio óptico. 35 , 36 METH es más polar que el etanol y, por lo tanto, no puede penetrar a través de las regiones de la cadena lipídica de las membranas celulares como puede hacerlo el etanol. 37 No obstante, debido a su pequeño tamaño, el metanol puede atravesar las membranas celulares a través de los poros. 38En folículos de ovario de pez cebra, la crioconservación con METH mostró una reducción dependiente de la dosis en cinco medidas de función mitocondrial: potencial de membrana, distribución mitocondrial, número de copias de ADN mitocondrial, niveles de trifosfato de adenosina (ATP) y difosfato de adenosina (proporciones ADP/ATP). 39 Un estudio de ovocitos de peces encontraron que las concentraciones de metanol por encima de 6 M (pero no por debajo) resultaron en daño proteico o proteolisis.40
El butanodiol tiene cuatro isómeros estructurales estables, de los cuales solo dos (1,3-butanodiol y 2,3-butanodiol, es decir , BD) se han usado como CPA. Se informa que las propiedades CPA del 1,3-butanodiol son similares a las del PG, aunque son ligeramente más tóxicos que el PG para los eritrocitos 41 y considerablemente más tóxicos que el PG para los blastocistos de ratón. 42 Una solución al 20 % vol/vol de 1,3-butanodiol es menos tóxica que BD para los blastocistos de ratón. 42
BD nominalmente tiene cuatro estereoisómeros, 43 pero dos son meso-isómeros idénticos que forman un hidrato que cristaliza fácilmente y es citotóxico. 44 , 45 Los otros dos estereoisómeros son los enantiómeros levo- y dextro-2,3-butanodiol, que tienen propiedades idénticas aparte de su diferente rotación de la luz polarizada. 46 Una mezcla racémica de los enantiómeros que contiene solo un 3,1 % p/p del mesoisómero no es tóxica para los eritrocitos hasta un 20 % p/p, pero es más tóxica que la PD al 30 % p/p. 46 No obstante, BD tiene una concentración mínima necesaria para vitrificar (Cv) mucho más baja que PD. 47Sería más apropiado comparar la toxicidad de BD y PD en sus respectivos valores Cv en lugar de igual % p/p. El gasto ha limitado el uso de BD en criobiología, por lo que se han hecho intentos para reducir el costo. 48 , 49
Hay una reducción dependiente de la dosis en la frecuencia cardíaca de la rata para concentraciones de DMSO superiores a 0,14 M (1% vol/vol). 50 Se producen alteraciones ultraestructurales irreversibles en el miocardio de rata por encima de 1,41 M (10 % vol/vol) de DMSO a 30 °C, y por encima de 2,82 M de DMSO a 15 °C. 50 Se cree que el estrés osmótico es al menos parcialmente responsable de estos efectos. 50 Otro estudio mostró un aumento en la duración del potencial de acción asociado con la contracción de las células miocárdicas en el músculo cardíaco de cobayo expuesto a DMSO al 10 % durante 30 minutos a temperatura ambiente. 51 Aparte de los efectos osmóticos, una explicación sugerida es la acción de bloqueo directo sobre las proteínas de los canales de membrana por parte de las moléculas de DMSO. 51
Los fibroblastos dérmicos expuestos a DMSO en concentraciones crecientes entre 5 % y 30 % (vol/vol) a 4 °C, 25 °C y 37 °C durante períodos de 10, 20 y 30 min mostraron una viabilidad decreciente con el aumento de la concentración y la temperatura. y tiempo de exposición. 52 El aumento de la concentración de DMSO del 7,5 % al 10 % reduce el potencial clonogénico de las células progenitoras de sangre periférica. 185 fibroblastos de hámster expuestos durante 1 hora a DMSO al 10 % a 37 °C mostraron ondulaciones en la membrana celular sin hinchazón, el DMSO al 20 % provocó la entrada de agua y la hinchazón, y el DMSO al 30 % provocó ampollas en la membrana plasmática que indican disociación entre la membrana plasmática y el citoesqueleto. 53Los condrocitos mostraron una recuperación decreciente al aumentar la temperatura (4 °C, 22 °C, 37 °C) y al aumentar la concentración de DMSO (7,5 %, 22 %, 37 %, 44 %) al aumentar el tiempo entre 0,5 min y 120 min. 54
A 20 °C, el DMSO se une cada vez más a las proteínas en concentraciones superiores al 40 %, lo que puede provocar el desdoblamiento de las proteínas. 55 , 56 Se ha observado una unión irreversible considerable de DMSO a la proteína a 10 °C. 57 Se ha demostrado que el DMSO reacciona tanto con la proteína del cristalino como con el glutatión. 58
Se ha informado que el DMSO disminuye la firmeza y aumenta la fluidez de las membranas celulares. 59 A 77 °C, el DMSO reduce el grosor de la membrana celular en concentraciones bajas (2,5 %–7,5 %), provoca la formación de poros de agua transitorios en concentraciones intermedias (10 %–20 %) y destruye la estructura bicapa en concentraciones más altas (25 %). %–30%). 52 Aunque el DMSO puede estabilizar la fase de gel de las membranas celulares, 60 concentraciones superiores al 40 % de DMSO hacen que la estructura de la fase de gel de las bicapas de ceramida experimente una transición de fase de gel a líquido cristalino. 61Todos estos efectos deberían aumentar con el aumento de la temperatura. Tanto la hidrofilia del DMSO como la capacidad del DMSO para desestabilizar la conformación de la proteína aumentan con el aumento de la temperatura. 62
El DMSO protege a los hepatocitos de rata de la apoptosis a una concentración del 1 % al desplazar la caspasa-9 al núcleo (donde no puede iniciar la apoptosis). 63 En células de hipocampo de rata juvenil cultivadas, el DMSO causó apoptosis de una manera dependiente de la dosis entre 0.5% y 1.0% de concentración. 64 En las líneas celulares de linfoma, el DMSO tiene un efecto antiapoptótico en el rango de concentración entre 1 % y 2 % durante 4 a 6 días, 58 pero el DMSO se vuelve proapoptótico en concentraciones más altas. 65 , 66 Las pruebas de Ames de bacterias con DMSO al 33 % durante 10 min mostraron un aumento de 10 veces en la mutagenicidad. 67
Las células cocleares de crías de rata mostraron un aumento dependiente de la dosis en la apoptosis cuando se expusieron a concentraciones de DMSO entre 0,5 % y 6 % durante 24 horas. 68 Células de retina de rata expuestas a concentraciones de DMSO tan bajas como 0,1 % vol/vol durante 24 h exhibieron apoptosis. 69 El DMSO inhibió la respiración mitocondrial y elevó el calcio cistólico. 62 Para varios tipos de células, incluidos los fibroblastos, el DMSO al 1% aumentó el calcio intracelular de dos a seis veces en 5 segundos. 70 El aumento de calcio intracelular puede conducir a la apoptosis. 71 El DMSO puede aumentar el área de superficie de las células de los osteoclastos cuando no se usa en altas concentraciones (las altas concentraciones inducen la apoptosis de los osteoclastos). 72
Individualmente, GLY, DMSO, PG y BD causaron la pérdida de células endoteliales de la córnea después de una exposición de 10 a 15 minutos a 0 a 4 °C en concentraciones insuficientes para vitrificar. 73
Toxicidad de la membrana celular
La toxicidad de la membrana celular es un tipo particular de toxicidad específica, más frecuentemente asociada con DMSO. Las bicapas de la membrana celular consisten en grupos de cabeza polar hidrofílicos en las superficies externa e interna, con cadenas de ácidos grasos hidrofóbicos en el medio de la membrana. La capacidad de las moléculas para penetrar las membranas celulares aumenta con la lipofilia, pero disminuye con el aumento del tamaño molecular o la capacidad para formar enlaces de hidrógeno. 38
La vida útil de un enlace de hidrógeno DMSO-agua es varias veces la vida útil de un enlace de hidrógeno agua-agua. 74 El oxígeno sulfinilo (SO) del DMSO se une al agua con enlaces de hidrógeno con más fuerza (alrededor de 30 kilojulios/mol) que las moléculas de agua se unen entre sí (alrededor de 20 kilojulios/mol). La unión de 75 DMSO con agua disminuye al aumentar la temperatura. 76
Las membranas se "hidratan" más fácilmente con agua que con DMSO y, según se informa, esta exclusión relativa de DMSO provoca estrés en la interfaz de la membrana. 60 La hidrofobicidad y la concentración del DMSO en la bicapa lipídica disminuyen con el aumento de la temperatura, lo que puede ayudar a explicar el aumento de la toxicidad del DMSO con el aumento de la temperatura porque el DMSO se localiza alrededor de los grupos de cabeza polar de las membranas celulares. 60 , 77 , 78 Para temperaturas superiores a 5 °C, la adición de FMD a DMSO aumenta la alteración de los liposomas. 76
Un estudio de hemólisis de eritrocitos por alcanoles (alcanos que tienen un grupo -OH), alcanodioles (alcanos que tienen dos grupos -OH) y glicerol (que tiene tres grupos -OH) mostró que el grado de hemólisis dependía casi por completo del cambio de forma. inducida en los eritrocitos. Una proporción decreciente de la constante dieléctrica de la solución dividida por la constante dieléctrica de la membrana aumentó la hemólisis. Esta proporción reducida representó una diferencia más pequeña entre la hidrofobicidad de la membrana y la hidrofobicidad de la solución y condujo a un aumento del área superficial de la membrana expuesta al medio, o formación de vesículas en la membrana. El aumento de la longitud de la cadena de alcanol o alcanodiol dio como resultado un aumento de la hemólisis, mientras que la adición de un grupo hidroxilo a un alcanol para producir un alcanodiol redujo la hemólisis en comparación con el alcanol correspondiente. Las concentraciones de CPA que produjeron el 100 % de hemólisis a 20 °C solo produjeron entre el 5 % y el 10 % de hemólisis a 4 °C. Sobre la base de estos resultados, los autores especularon que la combinación de DMSO (constante dieléctrica menor que la del agua) con FMD (constante dieléctrica mayor que la del agua) podría reducir mutuamente la toxicidad de los dos CPA debido a los efectos opuestos de los dos CPA. sobre la hidrofobicidad de la solución.79 Cuando se usa por vía intravenosa, se ha demostrado que el DMSO causa hemólisis. 80 De los CPA comúnmente utilizados, solo FMD tiene una constante dieléctrica mayor que el agua.
Daño oxidativo debido a CPA
DMSO, METH, GLY y EG tienen capacidad antioxidante, siendo DMSO el más potente y GLY el menos. 81 , 82 Pero el DMSO puede ser un prooxidante al oxidar los grupos tiol libres en las proteínas (lo que afecta la función de las proteínas), 58 , 83 , 84 una reacción que se esperaría que disminuya a temperaturas más bajas.
La solución de vitrificación de plantas 2 (PVS2) contiene 30 % de GLY, 15 % de EG y 15 % de DMSO. 85 Las puntas de los brotes tratadas con PVS2 mostraron una peroxidación lipídica que podía reducirse con melatonina 86 o vitaminas C y E. 87 La peroxidación lipídica de la membrana en plántulas tratadas con PVS2 se redujo con glutatión y ácido ascórbico. 88
La crioconservación de ovarios de cerdo con una solución de vitrificación que contenía EG produjo daño oxidativo que se redujo con el tratamiento antioxidante. 89 Se ha demostrado que los antioxidantes reducen los efectos tóxicos de las células epiteliales del riñón expuestas al oxalato y al oxalato de calcio. Se ha demostrado que la 90 N -acetilcisteína reduce el estrés oxidativo inducido por el glicerol en el riñón. 22
Daño osmótico, choque por frío y daño por frío
El daño osmótico, el choque por frío y el daño por frío, a diferencia del daño oxidativo, no pueden considerarse como una forma de toxicidad por CPA. Pero estas formas de daño pueden confundirse con la toxicidad de CPA. Los CPA con baja permeabilidad pueden causar más estrés osmótico que los CPA con alta permeabilidad. Las permeabilidades de membrana de una variedad de no electrolitos, incluidos los CPA, se han estudiado en varios tipos de células, incluidas las células sanguíneas humanas. 38Los factores críticos que determinan la permeabilidad de la membrana son la solubilidad en lípidos de la sustancia (que aumenta la permeabilidad) y los enlaces de hidrógeno (que disminuyen la permeabilidad). En general, la permeabilidad disminuye a medida que aumenta el tamaño molecular de la sustancia. A diferencia de las células sanguíneas humanas, que son aproximadamente dos veces más permeables al DMSO que al GLY, el esperma humano es casi tres veces más permeable al GLY que al DMSO. 91 Tanto para los glóbulos rojos humanos como para los espermatozoides, la permeabilidad al EG es muy alta en comparación con otros CPA comúnmente utilizados. Sin embargo, para los ovocitos humanos maduros, PG tiene la permeabilidad más alta de los CPA de ovocitos más utilizados, y EG tiene la permeabilidad más baja ( Tabla 1 ). 92
Tabla 1. Coeficiente de permeabilidad de la membrana multiplicado por 10-5 cm/seg para glóbulos rojos humanos, esperma humano y ovocitos humanos
crioprotector Glóbulos rojos@4°C 38 Esperma @22°C 91 Ovocitos @22°C 92
metanol 11.35
formamida 8.05
Etilenglicol 3.38 13.2 1,95
Propilenglicol 1.79 3.83 3.83
Dimetilsulfóxido 1.30 1.33 2.60
Glicerol 0.58 3.50 Bajo
Para una variedad de tipos de células, DMSO tiene muchas veces la permeabilidad de membrana de GLY. 93 EG tiene aproximadamente la mitad de la permeabilidad de PG o DMSO para los ovocitos humanos (y, por lo tanto, aumenta el daño de la membrana por estrés osmótico), pero EG es el CPA preferido porque es menos tóxico. 94 Para los ovocitos de cerdo, la crioconservación con PG resultó en una mayor supervivencia que con EG debido a una mayor permeabilidad (y menos daño a la membrana osmótica); pero la competencia de desarrollo de los ovocitos que sobrevivieron a la crioconservación fue mayor para EG, lo que sugiere que PG es más tóxico. 95 El esperma humano crioconservado con 1 M de EG mostró más viabilidad que el esperma crioconservado con 1 M de GLY, supuestamente porque el EG es cuatro veces más permeable a la membrana y, por lo tanto, causa menos daño osmótico. 91Sin embargo, 2 M de EG no dieron como resultado una mejor motilidad que 1 M de GLY, posiblemente debido a la toxicidad de EG. 91 Para los embriones de lenguado, EG causa mucho menos estrés osmótico que METH, pero es mucho más tóxico. 96 El uso de la supervivencia hasta la eclosión como ensayo de toxicidad para embriones de platija expuestos a CPA durante 60 min a −15 °C dio como resultado el siguiente orden de toxicidad de CPA, siendo EG el más tóxico: EG > glicerol > DMSO > METH > PG. 96 Pero combinar 20 % de METH con 5 % de cualquiera de los otros CPA resultó en una toxicidad mucho menor que combinar 20 % de PG, EG o DMSO con 5 % de cualquiera de los otros CPA (excepto METH). 96
Aunque la tasa de permeación en el cartílago articular del cerdo disminuye en forma de Arrhenius con la temperatura para los CPA, la tasa de disminución varía significativamente según el CPA. Mientras que la velocidad de difusión del DMSO disminuye un 25 % de 0 °C a -10 °C, hay una disminución de la velocidad de difusión del 50 % para PG y GLY en el mismo rango de temperatura. 97
Probar los tiempos de exposición y permitir suficiente tiempo de permeación para evitar el estrés osmótico en cortes de tejido de riñón de conejo llevó a la conclusión de que el estrés osmótico no es la causa principal de la toxicidad de CPA para los métodos y preparaciones de esos experimentos. 98 Pero el daño osmótico a menudo se asocia con la crioconservación de otras células o tejidos. El estrés osmótico excesivo puede interferir con la estructura de la proteína y reducir la actividad enzimática mientras causa daño al ADN y muerte celular apoptótica. 99
Las células endoteliales vasculares expuestas a BD, PG, DMSO y EG en sus concentraciones vitrificantes a 2–4 °C durante 9 min mostraron una supervivencia significativamente mayor para BD o PG que para DMSO o EG. La permeabilidad es más alta para BD (4,1), seguido de PG (3,0) y luego DMSO (2,4) y EG (2,0) (todas las unidades en cm/seg × 10-6 ). Elevar la temperatura de 2 a 4 °C a 22 °C aumentó la permeabilidad 17 veces para BD y DMSO, pero solo 13 veces para PD y nueve veces para EG. El BD es mucho más tóxico que el PD en concentraciones equivalentes, pero en las concentraciones requeridas para vitrificar (32 % p/p para BD y 45 % p/p para PG), se informó que el BD era menos tóxico. 47 (Se informó que las concentraciones para vitrificar indicadas en este documento eran incorrectas. 100) El artículo no sugería si la permeabilidad era un factor en la supervivencia celular. La permeabilidad a los CPA como GLY puede variar considerablemente según el tipo de célula: GLY es altamente permeable para los glóbulos rojos humanos, pero tiene una permeabilidad muy baja para los glóbulos rojos bovinos. 47
El daño por frío se refiere al daño inducido en las células mantenidas a temperaturas críticas por debajo de las temperaturas a las que normalmente funcionan las células, mientras que el choque por frío se refiere a la reducción de la viabilidad debido a una disminución rápida o grande de la temperatura. Existe cierta superposición en el efecto sobre los orgánulos celulares del choque por frío y la lesión por frío, especialmente en las membranas celulares. También existe cierta confusión en la terminología utilizada, al menos parcialmente asociada a la falta de claridad sobre los mecanismos.
El choque por frío afecta de manera más inmediata los lípidos unidos a la membrana, la conformación de proteínas y la conformación de ácidos nucleicos. El choque frío inhibe la traducción del ARNm, se inducen proteínas de choque frío y aumenta la síntesis de más ácidos grasos insaturados para aumentar la fluidez de la membrana. 101 La traducción inicial del ARNm parece ser el punto de control clave para la respuesta al choque por frío en las células de los mamíferos, y el daño oxidativo puede estar involucrado. 102 Se inhibe la actividad enzimática unida a la membrana y se reducen las velocidades de difusión. Las proteínas de choque frío pueden reclutar ARNm y ribosomas al citoesqueleto para su traducción. 103
Un mecanismo de lesión por frío en las células animales probablemente se deba a las transiciones de fase en las membranas celulares. 104 Se esperaría que los lípidos en las membranas celulares experimenten una transición de fase líquida a gel en un rango entre 0 °C y 20 °C, el rango de temperatura de máxima lesión por frío. La sensibilidad al frío se ha reducido en las plantas mediante la introducción de dobles enlaces en los ácidos grasos de las membranas celulares a través de la manipulación genética 105 y en los ovocitos de las ovejas al alimentar a las ovejas con ácidos grasos insaturados. 106 Las plaquetas son excepcionalmente vulnerables al daño por frío y han servido como modelos para la disfunción inducida por el frío. 107
El daño por frío aumenta con el tiempo de exposición a temperaturas críticas y, de hecho, el enfriamiento rápido a través del rango de temperatura crítica puede ser un medio para reducir el daño por frío. 108 Los embriones de pescado, que son vulnerables tanto a la sensibilidad al frío como al choque por frío, no pueden criopreservarse mediante un enfriamiento tan rápido. 109 El metanol protege a los embriones de pez cebra del daño por frío, un beneficio que se especula que se debe a la posible depresión de las temperaturas de transición de fase en las membranas lipídicas. 110 La polimerización de los microtúbulos en los ovocitos es muy sensible a la temperatura y la despolimerización completa de los microtúbulos puede ocurrir justo por encima de 0°C. 111 En algunos casos, la repolimerización del huso meiótico ocurre al recalentarse, 112pero en otros casos, las configuraciones cromosómicas irregulares y la organización anormal de tubulina permanecen después del recalentamiento. 113
Aunque la sensibilidad al frío se ha reducido en las plantas al aumentar el grado de insaturación de ácidos grasos, 105 gran parte del daño por frío (o choque por frío) en las plantas se ha atribuido al daño de los radicales libres. 114 También se ha observado evidencia de daño por radicales libres durante el enfriamiento en moscas domésticas 115 y esperma 116 (las membranas de los espermatozoides tienen un alto contenido de ácidos grasos poliinsaturados).
Se han realizado experimentos de enfriamiento de cortes corticales de riñón de conejo en solución de vitrificación en los que se utilizó la viabilidad (proporción de potasio a sodio [K + /Na + ]) como índice de daño por frío (o shock por frío) y han indicado un aumento lineal en ( presuntamente) daño por frío de 0°C a −85°C. 117 El análisis de la expresión génica que mostró "daño por frío" durante el enfriamiento lento a -80 °C indicó la inducción de genes relacionados con el estrés y la inflamación. 117 Las soluciones hipertónicas en el rango de 1,2 a 1,5 veces la isotonicidad eliminaron por completo el daño por frío entre 0°C y −22°C. 118Se minimizó el daño por frío hasta -135 °C (85 %–90 % de viabilidad) enfriando hasta -22 °C con una hipertonicidad de 1,2 × y enfriando más hasta -135 °C con una hipertonicidad de 1,5 ×. 118 Evidentemente, cierta contracción celular protege contra el daño por frío.
Toxicidades CPA comparativas
Se analizaron las líneas celulares de ovario de hámster chino para determinar el daño cromosómico después de la exposición a DMSO, PG y EG. No se observó daño cromosómico para DMSO o EG, pero se observó daño cromosómico sustancial para PG. Cuando se añadió un sistema de oxidación de citocromo P450, EG, pero no DMSO, mostró daño cromosómico sustancial. 119 Se ha demostrado que el citocromo 450 metaboliza el EG a formaldehído en ratas. 120 En mezclas de criopreservación de ovocitos de ratón, PG provocó una fragmentación significativa del ADN, mientras que EG y DMSO no lo hicieron 121 ; 99% DMSO, FMD o METH disuelve el ADN. 122
Un estudio de ovocitos de ratón que comparó EG con DMSO encontró que ambos CPA aumentaron el calcio intracelular, pero solo para DMSO había una fuente de calcio intracelular. 123 Un estudio diferente que comparó los CPA para la crioconservación de ovocitos de ratón, PG, DMSO y EG aumentaron el contenido de calcio intracelular, con PG aumentando el calcio en mayor medida y EG aumentando el calcio en menor medida. 124 La fuente de calcio para PG y EG era extracelular, mientras que para el DMSO la fuente era intracelular 124 (como en el primer estudio).
DMSO, PG y GLY mostraron concentraciones crecientes de formaldehído en función del aumento de la molaridad en los ovocitos de ratón, pero el aumento de formaldehído para PG fue más de 30 veces mayor que para DMSO o GLY. 125 La eliminación del formaldehído redujo el endurecimiento de la zona pelúcida. Aunque se desconoce el mecanismo de producción de formaldehído, los autores sugieren que se debe a una reacción no enzimática en el CPA y el solvente. 125
Las concentraciones mínimas de CPA que dieron como resultado una reducción significativa de la supervivencia de la mórula de ratón con 5 min de exposición a 25 °C fueron EG (7 M), GLY (6 M), DMSO (5 M) y PG (4 M). 126 METH fue el segundo CPA menos tóxico después de EG, mostrando una supervivencia de mórula de ratón reducida después de 10 min de exposición a 6 M. 126
Para los blastocistos de ratón expuestos a 30 % vol/vol de CPA durante 10 min a temperatura ambiente, el EG fue con mucho el menos tóxico (74,6 % de los blastocistos desarrollados posteriormente) en comparación con DMSO (25,0 %), GLY (21,9 %), BD (8,7 %). %), PG (2,1 %) o 1,3-butanodiol (1,7 %). 42 Para los blastocistos de ratón expuestos a 20 % vol/vol de CPA durante 40 min a temperatura ambiente, el DMSO fue el menos tóxico (96,7 % sobrevivió), seguido de EG (95,8 %), PG (87,5 %), GLY (81,7 %), 1,3-butanodiol (64,2 %) y BD (8,3 %). 42
Para las células beta de ratón, se encontró que el DMSO es más tóxico que el PG para un rango de concentraciones y un rango de temperaturas por encima de 0°C. 127 Sobre la base de las pruebas de dos tipos de células, los autores concluyeron que la toxicidad de CPA es mayor para las células con mayor actividad metabólica. 127 Las toxicidades de EG y DMSO para las células endoteliales fueron mucho mayores que las toxicidades de PD y BD. La reducción de la concentración de BD de 3,0 M a 2,0 M redujo la pérdida de células endoteliales por un factor de 35, mientras que la misma reducción molar de DMSO solo redujo la pérdida de células endoteliales por un factor de 3.73
Se determinó que BD era menos tóxico para las células endoteliales vasculares que DMSO, PG o EG. 128 En otro experimento, el mismo equipo de investigación encontró que la exposición de las células endoteliales vasculares a concentraciones vitrificantes de BD (2,3 butanodiol) (32 %), PG (45 %), DMSO (45 %) y EG (45 %) a 2–4 °C durante 9 min dio como resultado la mayor supervivencia celular con BD y la menor supervivencia con EG. Cuantitativamente, estas tasas fueron BD (76,3 % de supervivencia), PG (63,6 %), DMSO (37,0 %) y EG (33,2 %), 47 pero el equipo afirmó que las concentraciones necesarias para vitrificar eran del 32 % para BD y del 45 % para DMSO, EG y PG, que según se informa es incorrecto. 100 La comparación de las toxicidades de los CPA debe hacerse en Cv para los CPA en lugar de para concentraciones porcentuales iguales de los CPA.
La hipótesis qv* de la toxicidad del CPA
Gregory Fahy lleva mucho tiempo estudiando la toxicidad del CPA y la neutralización de la toxicidad. 3 , 7 , 8 , 129 Fahy y sus colegas de 21st Century Medicine, Inc. (21CM) han ideado una teoría de la toxicidad de la CPA basada en ensayos de K + /Na + de rodajas de riñón de conejo, un intento ambicioso de establecer una teoría general de la CPA toxicidad.
La concentración de Na + fuera de una célula suele ser 10 veces mayor que la que se encuentra dentro de una célula, mientras que la concentración de K + dentro de una célula suele ser de 20 a 35 veces mayor que en el exterior. La enzima de membrana Na/K-ATPasa (la “bomba de sodio”) utiliza una molécula de ATP para expulsar 3 iones Na + a cambio de 2 iones K + que ingresan a la célula. 130 Si la membrana celular se rompe, o si una célula muere o ya no es capaz de producir ATP, la proporción intracelular normal de K + /Na + se verá alterada. Por lo tanto, la viabilidad celular se puede ensayar lavando el material extracelular, lisando las células de la muestra y determinando las concentraciones relativas de K + y Na +.. 57
Fahy y sus colegas crearon una métrica denominada "qv*" que se propone para medir la fuerza promedio de los enlaces de hidrógeno entre los grupos polares de CPA y las moléculas de agua en una solución. Cuantitativamente, qv* representa el número de moles de agua por unidad de volumen dividido por el número de moles de grupos polares en el CPA a la concentración mínima necesaria para vitrificar en condiciones estandarizadas 8 : q = M W (moles de agua)/M PG ( moles grupos polares), para v (concentración mínima necesaria para vitrificar, Cv) en condiciones estandarizadas (*). Cuanto menor sea la concentración mínima necesaria para vitrificar (v), más fuerte será el CPA.
Los grupos polares se definen como S O, C O, OH y NH 2 , que se describen con mayor precisión como grupos de enlace de hidrógeno. Los dos primeros grupos ( SO y C O) formarán enlaces de hidrógeno con un hidrógeno de agua, mientras que los hidrógenos de los dos últimos grupos (OH y NH 2 ) formarán enlaces de hidrógeno con un oxígeno de agua. Por supuesto, también se producirán enlaces de hidrógeno entre los CPA y con otras moléculas en solución.
Un gráfico de qv* frente a la medida de viabilidad (proporción K + /Na + ) indica una viabilidad decreciente con un qv* creciente. Por lo tanto, qv* es una medida del poder vitrificante de las soluciones de CPA y está inversamente correlacionado con la viabilidad.
Fahy interpreta que toda la toxicidad medida en el eje vertical de la Fig. 1 no es específica. 8 Fahy afirma que la Fig. 1demuestra que un mayor qv* da como resultado una mayor toxicidad no específica, e interpreta que la toxicidad no específica se debe a que hay menos moléculas de agua disponibles para hidratar las macromoléculas de manera protectora. Por lo tanto, una solución de CPA con un qv* más alto será más tóxica porque menos grupos polares forman enlaces de hidrógeno con más moléculas de agua. Un CPA que pueda vitrificar con un qv* más bajo será menos tóxico. Se prefiere EG sobre PG porque EG tiene una fuerza de enlace de hidrógeno promedio más débil por molécula polar, menos toxicidad no específica y deja más moléculas de agua disponibles para hidratar macromoléculas en Cv para EG. (Sin embargo, Fahy describe a EG como un caso atípico debido a toxicidades específicas [Solución 11, Fahy, 2004].) 8
HIGO. 1.
HIGO. 1. La línea superior incluye los puntos que respaldan con más fuerza la hipótesis qv*, mientras que la línea inferior incluye solo dimetilsulfóxido (DMSO) y dos soluciones descritas como "valores atípicos", una línea que respalda más débilmente la hipótesis qv*. Reimpreso con autorización; Fahy 2010. 129
Se dan dos ejemplos para calcular qv*. Se ha determinado que el Cv de glucosa en agua es del 84 % p/vol 131 a una velocidad de enfriamiento de 10 °C/min (la condición estandarizada para este experimento, denominada "*"). Por lo tanto, qv* se puede calcular de la siguiente manera:
Proyectar la línea superior en la Fig. 1 hacia atrás indica que cualquier valor de qv* por debajo de aproximadamente 1,5 corresponderá al 100 % de viabilidad. Entonces, el valor qv* de 0.704 indica que la glucosa no debería tener toxicidad no específica.
Para el segundo ejemplo, qv* se calcula para la solución de DMSO más polivinilpirrolidona K30 (PVP) (solución 1 de Fahy 2004 8 ) utilizando las condiciones estandarizadas descritas en la Tabla 1 del documento que postula la hipótesis qv*. 8 La solución 1 incluye PVP al 6 % y una solución portadora de 2 ml/100 ml para una presión de 100 MPa (alrededor de 1000 atmósferas) y una velocidad de enfriamiento de 10 °C/min (la condición estandarizada para este experimento*). La alta presión y la presencia de PVP significa que el Cv de DMSO será inferior al 49 % p/vol indicado en la Tabla 2de este artículo. En estas condiciones, el Cv de la solución total (DMSO + PVP) es 47 % p/vol y el Cv de DMSO es 47 − 6 = 41 % p/vol. No se contaron los grupos polares para PVP, porque PVP no es un CPA permeante, a pesar de que PVP reduce el Cv para DMSO en la solución.
Tabla 2. Concentración necesaria para vitrificar (Cv) para crioprotectores penetrantes seleccionados a una presión atmosférica
CPA CV % peso/vol
PG 43.5
DMSO 49–50
P.EJ 55
GLY sesenta y cinco
Los valores para todos los CPA se tomaron de Fahy 1984 100 e incluyen soluciones portadoras de 2 ml/100 ml de solución.
CPA, crioprotector; PG, propilenglicol; DMSO, dimetilsulfóxido; EG, etilenglicol; GLY, glicerol.
Tanto el 1,2-propanodiol como el 1,3-propanodiol tienen dos grupos OH polares, pero en comparación con la molécula de 1,2-propanodiol, el 1,3-propanodiol tiene una concentración más alta necesaria para vitrificar (57 % frente a 44 %). 132 Por lo tanto, la hipótesis qv* predice correctamente que el PG será más tóxico.
Algunas preguntas sobre la hipótesis Qv*
Los grupos polares S O, C O, OH y NH 2 no tienen la misma fuerza de enlace de hidrógeno, y la fuerza de enlace de hidrógeno de cada uno de esos grupos variará en un rango dependiendo de la pareja de enlace de hidrógeno. Por ejemplo, el grupo OH en METH se une al agua casi un 20% más fuertemente que los enlaces de hidrógeno entre las moléculas de agua. 31 NH 2 se cuenta como un solo grupo polar, a pesar de la posibilidad de que NH 2 pueda presentar dos átomos de hidrógeno para formar enlaces de hidrógeno. Del mismo modo, sólo el NH 2 y CLos grupos O en la fiebre aftosa se cuentan como grupos polares (dos grupos polares), a pesar de que el oxígeno, el nitrógeno y tres átomos de hidrógeno están potencialmente disponibles para formar enlaces de hidrógeno. Otros investigadores han sugerido que un grupo hidroxilo puede formar dos enlaces de hidrógeno, mientras que un grupo amida puede formar tres. 133 Los enlaces de hidrógeno intramoleculares aumentan a medida que los grupos hidroxilo se acercan. 133 En su artículo de 2010 sobre la neutralización de la toxicidad, Fahy comentó que solo un NH 2 en la urea puede contribuir a la toxicidad o que la polaridad general de la molécula de urea es más importante para la toxicidad que los grupos polares individuales. 129 Este comentario entra en conflicto con la justificación de contar grupos polares para calcular qv*.
Los enlaces de hidrógeno son mucho más fuertes en un ambiente no polar que en un microambiente polar. 134 Los enlaces de hidrógeno entre las moléculas de agua pueden volverse hasta seis veces más fuertes en un medio ácido o básico. 135 Agregar un grupo metilo a un alcohol, como ocurre esencialmente al pasar de EG a PG, da como resultado un aumento de la fuerza de los enlaces de hidrógeno de los oxígenos en los grupos hidroxilo, 132 reduciendo así el Cv mientras aumenta la toxicidad.
Al plantear la hipótesis qv*, los autores afirman: “qv* es una medida de la eficiencia de formación de vidrio de los CPA que componen la solución de vitrificación”. 8 Pero Cv mide la eficacia de formación de vidrio, por lo que tratar cada grupo polar como si hiciera una contribución igual a qv* cuando en realidad no son iguales debe introducir imprecisión, a pesar de que qv* está destinado a determinar las fuerzas de enlace de hidrógeno promedio de todos los grupos polares contados.
La determinación precisa de las fuerzas de los enlaces de hidrógeno de cada uno de los grupos polares posiblemente podría permitir cálculos de tipo qv* más precisos. La fuerza de los enlaces de hidrógeno a menudo no se puede determinar directamente, razón por la cual los expertos en enlaces de hidrógeno prefieren usar las longitudes de los enlaces de hidrógeno como un sustituto más fácil de medir para la fuerza de los enlaces de hidrógeno. 136 La longitud de un hidroxilo de hidrógeno enlazado con hidrógeno a un oxígeno es ligeramente más corta (más fuerte) que la longitud de una amina de hidrógeno enlazada con hidrógeno a un oxígeno. 136
Según la hipótesis qv*, la toxicidad y la eficacia de la vitrificación son el resultado del mismo proceso: la unión de hidrógeno de los CPA a las moléculas de agua, aunque una solución de vitrificación que requiera más grupos polares por molécula de agua para vitrificar será menos tóxica. La vitrificación puede ocurrir ya sea por un fuerte enlace de hidrógeno de las moléculas de agua con un CPA que tiene una concentración más baja necesaria para vitrificar (como PG), o por un enlace de hidrógeno débil del agua con un CPA que requiere una concentración más alta para vitrificar (como EG). De acuerdo con la hipótesis qv*, el CPA con enlaces de hidrógeno más débiles será menos tóxico porque habrá más moléculas de agua disponibles para hidratar las macromoléculas. 8Aunque también habrá más moléculas de agua disponibles para formar hielo, la "dilución" coligativa de agua por el CPA débil debería evitar la formación de hielo. Parece contradictorio que el agua permanezca disponible para la hidratación, pero no disponible para la formación de hielo. Por definición, las moléculas de agua que hidratan macromoléculas están unidas a esas macromoléculas ("agua unida"). Solo las moléculas de agua que no están unidas a macromoléculas ("agua no unida") son capaces de formar hielo. Si los CPA se unen con enlaces de hidrógeno tanto al "agua unida" como al "agua no unida", entonces es posible que menos enlaces de hidrógeno por parte de los CPA permitan que más "agua unida" hidrate macromoléculas.
El ensayo K + /Na + mide la toxicidad, pero no distingue entre toxicidad específica e inespecífica. La viabilidad podría verse reducida por muchas toxicidades específicas además de la falta de hidratación de la macromolécula que resulta de la unión de los CPA al agua atribuida a una toxicidad no específica. Aunque Fahy informó que el DMSO al 30% p/vol tiene poco efecto sobre el K + /Na + , 7Se ha proporcionado amplia evidencia al comienzo de esta revisión sobre las toxicidades específicas del DMSO en concentraciones por debajo del 41% p/v que es la base del valor calculado de qv* para DMSO. Y combinar DMSO con CPA PVP no penetrante (sin contar los grupos polares en PVP) para reducir el Cv de DMSO del 47 % al 41 % parece dudoso (aunque todos los CPA penetrantes utilizados por Fahy para determinar qv* tenían CPA no penetrantes).
Hay tres puntos extremos notables en el gráfico de viabilidad (K + /Na + ) versus qv* ( Fig. 1 ) que demuestran una relación entre las dos variables para una variedad de CPA. 8 El primero más extremo, DMSO con un valor qv* de 6.02 (descrito por Fahy como un “punto de anclaje”), más que cualquier otro punto define el gráfico y justifica la hipótesis qv*. Los otros dos puntos extremos (junto con DMSO) definen una línea debajo de la línea de hipótesis qv*. EG con un valor qv* de 2,11 (solución número 11 de la Tabla 1 del artículo de 2004 que define qv* 8 ) se describe como un valor atípico debido a una toxicidad específica inexplicada, 8aunque no se puede dar la misma explicación para la solución número 7. La fuerza de los enlaces de hidrógeno de los CPA con el agua se debilita a medida que aumenta la concentración de CPA. 137 La métrica qv* no tiene en cuenta este hecho.
Toxicidad reducida al combinar CPA
Se dice que la FMD es la CPA más tóxica, 129 pero la FMD no se une fuertemente al agua 138 y no puede vitrificarse por sí sola. La fiebre aftosa presumiblemente tiene toxicidades específicas más que inespecíficas. Durante años, Fahy creyó que la fiebre aftosa reduce la toxicidad del DMSO pero no al revés; sin embargo, en 1990 encontró evidencia de que la fiebre aftosa no reduce la toxicidad del DMSO. 7 En 1995, encontró evidencia de que el DMSO reduce la toxicidad de la fiebre aftosa. 139 Según se informa, el DMSO no forma puentes de hidrógeno con la fiebre aftosa a 4 °C, y las dos moléculas evidentemente se repelen entre sí en una solución acuosa. 139Debido a que la fiebre aftosa se autoasocia más fuertemente que los asociados con DMSO o agua, lo que parece ser una reducción de la toxicidad del DMSO por la fiebre aftosa en solución acuosa podría ser simplemente un efecto de dilución. La acetamida tiene una toxicidad notablemente baja para los cortes de riñón, pero es menos susceptible que la fiebre aftosa a la neutralización de la toxicidad por DMSO. 129 El mecanismo de reducción de DMSO de la toxicidad de la fiebre aftosa sigue sin explicarse.
Un estudio del efecto de la toxicidad de CPA sobre la viabilidad de los condrocitos articulares de cerdo a 37 °C encontró que PG era el más tóxico, DMSO y FMD algo menos tóxico, mientras que EG y GLY eran los menos tóxicos. La viabilidad se ensayó sobre la base tanto de la integridad de la membrana como de la actividad metabólica. Se tuvo cuidado de evitar el daño osmótico usando una concentración de solución no superior a 3 M. El tiempo máximo de exposición fue de 120 min. Todas las combinaciones de CPA mostraron una reducción de la toxicidad, con PG o FMD combinados con DMSO mostrando ambos una toxicidad equivalente según lo evaluado por la viabilidad celular. La combinación de DMSO con FMD mostró una toxicidad muy reducida por debajo de la de DMSO o FMD solos. 140Este resultado se interpretó para indicar que tanto el DMSO reduce la toxicidad de la fiebre aftosa como la fiebre aftosa reduce la toxicidad del DMSO. Como se indicó en el párrafo anterior, la interpretación de Fahy sería que la reducción aparente de la toxicidad del DMSO por la fiebre aftosa es por dilución en lugar de por neutralización de la toxicidad. Los autores concluyeron que todas las combinaciones de dos CPA eran menos tóxicas que los CPA individuales a la misma concentración final. Una solución 3 M de EG-DMSO-GLY conservó mejor la integridad de la membrana, mientras que 3 M EG conservó mejor la actividad metabólica.
Cuando el equipo utilizó condrocitos humanos para estudiar la toxicidad de soluciones 6 M y 8,1 M de DMSO, EG, FMD, GLY y PG a 37 °C, encontraron que todas las combinaciones de tres CPA que examinaron tenían interacciones que reducían la toxicidad. Las combinaciones de dos CPA y cuatro CPA, por el contrario, tenían una mayor toxicidad. La toxicidad de las combinaciones de dos CPA se atribuyó a las interacciones CPA-CPA. No se explicó por qué los condrocitos humanos en lugar de los de cerdo o por qué una mayor concentración de CPA daría lugar a resultados diferentes para las combinaciones de dos CPA, aunque los resultados no fueron estrictamente comparables porque las concentraciones de CPA diferían entre los experimentos. La combinación de PG con cualquiera de los otros CPA resultó en una mayor toxicidad en comparación con las otras combinaciones. Los autores especularon que PG podría polarizar las cargas moleculares de los otros CPA,141
La combinación de DMSO y EG mostró una toxicidad reducida para los ovocitos de búfalo. 14 Los ovocitos de ratón expuestos a soluciones 1,5 M de DMSO, PG y EG a 23 °C durante 15 min mostraron una supervivencia considerablemente mayor para DMSO y EG que para PG. Pero la combinación de DMSO y PG redujo considerablemente la toxicidad de ambos CPA, lo que aumentó la supervivencia celular. 143 Se han crioconservado con éxito blastocistos de ratón usando una solución de vitrificación compuesta de EG, DMSO y 1,3-butanodiol. 142 La hemólisis de BD que contenía 3,1 % p/p de mesoisómero a 4 °C se redujo drásticamente al agregar 4 % p/p de trehalosa, sacarosa, sorbitol o manitol. 144 La trehalosa y la sacarosa redujeron la hemólisis más eficazmente que el sorbitol o el manitol.
Comprender los medios por los cuales la combinación de CPA reduce la toxicidad de CPA podría ser una forma de comprender los mecanismos de toxicidad de CPA, así como una forma de encontrar mejores combinaciones. Los efectos específicos de células o tejidos son importantes para esa comprensión.
Criopreservación que minimiza la toxicidad de CPA
En la medida en que la toxicidad de la CPA es el factor clave que limita la vitrificación, una investigación sobre el tema de la toxicidad de la CPA debería dirigirse idealmente a encontrar medios para minimizar esa toxicidad. En la medida en que el daño oxidativo, el daño osmótico, el choque por frío o el daño por frío estén implicados en el daño que podría atribuirse erróneamente a la toxicidad del CPA, se deben hacer esfuerzos para identificar de manera decisiva la causa del daño.
Como se describe en la sección anterior, las mezclas de CPA pueden ser menos tóxicas que las CPA individuales. Este hecho podría suscitar sospechas sobre la existencia de un concepto de “toxicidad no específica” común a todos los CPA como consecuencia de los enlaces de hidrógeno del agua por parte de los CPA. La neutralización de la toxicidad podría ser un efecto de dilución si toda la toxicidad de CPA fuera específica. Comprender los mecanismos de neutralización de la toxicidad podría ser un paso importante hacia el descubrimiento de los mecanismos de la toxicidad de la CPA y hacia el descubrimiento de mejores medios para reducir la toxicidad de la CPA.
La alta presión reducirá la concentración de CPA necesaria para vitrificar (Cv), reduciendo así la toxicidad de la solución de vitrificación requerida. A una presión de 200 MPa, la temperatura de nucleación homogénea del agua disminuye de -40 °C a -92 °C, de modo que incluso el agua pura puede vitrificarse a velocidades de enfriamiento razonablemente alcanzables. 145 Las presiones inferiores a 100 MPa dañan menos los tejidos que las presiones superiores a 100 MPa. 100 Tales presiones se han usado anteriormente en la crioconservación, pero esta práctica rara vez se usa en la actualidad. 100
Los grupos polares CPA S O, C O, OH y NH 2 de la hipótesis qv* no son los únicos grupos polares en un solvente que pueden formar puentes de hidrógeno con el agua. Al igual que los CPA, los codisolventes cosmotrópicos (que generan pedidos) se unen a las moléculas de agua y actúan para modificar la estructura del agua mediante la formación de enlaces de hidrógeno. 146 , 147 Los cosolventes cosmotrópicos pueden ser iónicos (como carbonato, sulfato y Mg 2+ ) o no iónicos (como compuestos polihidroxilados como azúcares). Los aniones cosmotrópicos tienen una alta densidad de carga, son muy polarizables, interactúan más fuertemente con el agua de lo que el agua interactúa consigo misma y compiten con las moléculas de agua asociadas con las superficies de las proteínas (agua que hidrata las proteínas). 147Los codisolventes cosmotrópicos mejoran la estabilidad de las proteínas al ser preferentemente excluidos de la capa de solvatación de las proteínas. 147 , 148 El ADN se estabiliza mediante la sustancia cosmotrópica glucosa, mientras que la urea puede ser un codisolvente caotrópico hidrofóbico que provoca la desnaturalización de las proteínas. 149 , 150
Pero aunque los codisolventes cosmotrópicos tienen el mismo efecto deshidratante y de retención de agua que supuestamente tienen los CPA, se ha demostrado que los cosmotropos son más protectores que tóxicos. La protección cosmotrópica aparentemente se debe a las mismas propiedades atribuidas a la toxicidad bajo la hipótesis qv*. Los cosmotropos no vitrifican, pero tal vez como la fiebre aftosa (que no vitrifica por sí sola), los cosmotropos podrían ayudar a la vitrificación. Se ha demostrado que Ca 2+ y Mg 2+ aumentan la temperatura de transición vítrea del glicerol, 151 y HPO 4 2− aumentan la temperatura de transición vítrea de la trehalosa. 152Al igual que con la comparación de EG y PG, los cosmotropos podrían ayudar a la vitrificación de CPA mediante enlaces de hidrógeno débiles, dejando más agua disponible para la hidratación. La mejora cosmotrópica involuntaria ya puede implementarse mediante el uso de soluciones portadoras, que pueden reducir la toxicidad de CPA sin reducir la concentración de CPA. 57 , 153 , 154 Con el conocimiento de los mecanismos, podrían seleccionarse soluciones portadoras que minimicen la toxicidad de CPA. En la medida en que los CPA se vuelven menos tóxicos con el enfriamiento y tendrán diferentes grados de toxicidad según el CPA, se pueden introducir CPA más tóxicos (o concentraciones más altas de CPA) a una temperatura más baja para reducir la toxicidad del CPA. 2
Los CPA penetrantes (CPA que cruzan las membranas celulares y entran en las células) a menudo se usan con CPA no penetrantes (que no entran en las células) porque el hielo se forma más fácilmente extracelular que intracelularmente. 155 Dado que los CPA no penetrantes evitan la formación de hielo, las soluciones de CPA penetrantes no necesitan ser tan concentradas (o tóxicas). Los agentes bloqueadores de hielo son una clase especial de moléculas no penetrantes que pueden ayudar a la vitrificación al reducir la formación de hielo. Estos incluyen alcohol polivinílico 156 y poliglicerol. 157
Los CPA penetrantes discutidos en este documento (BD, DMSO, EG, FMD, GLY, METH y PG) son los que se usan más comúnmente en criobiología, pero se pueden usar otros CPA penetrantes, como urea, 129 acetamida, 129 N -metilformamida, 129 N , N -dimetilformamida, 129 dietilenglicol, 129 trietilenglicol, 158 n -propanol, 159 isopropanol, 159 1,3-propanodiol, 132 1,3-butanodiol, 42 2-metoxietanol, 160 y 3-metoxi-1, 2-propanodiol. 159Los ensayos masivos de mezclas de varias combinaciones de CPA pueden encontrar combinaciones que tengan baja toxicidad para varios tipos de células y tejidos.
El reemplazo de grupos hidroxilo por grupos metoxilo puede dar como resultado compuestos que son menos viscosos, interactúan más con el agua (menos interacción propia), vitrifican a temperaturas más altas, reducen la tasa de enfriamiento crítica en al menos un orden de magnitud y penetran las membranas celulares más fácilmente. . 160 La autointeracción de los grupos hidroxilo en los CPA reduce la interacción de los CPA con el agua, un efecto que no se observa con los grupos metoxilo en la medida en que el oxígeno de esos grupos puede interactuar con el agua, mientras que no hay interacción entre los grupos metoxilo. Pero la reducción de Cv puede resultar en un aumento de la toxicidad de CPA, lo que se ha demostrado en el caso del 2-metoxietanol en forma de daño de membrana visible bajo microscopio electrónico. 161
Los azúcares se utilizan a menudo como CPA extracelulares debido a su baja toxicidad. El cálculo de qv* para glucosa en agua anterior sugiere que no hay toxicidad no específica para la glucosa. Las ranas de madera del norte utilizan altas concentraciones de glucosa como agente crioprotector, tanto intracelular como extracelularmente. 162 , 163 Sin embargo, la glucosa tiene toxicidades específicas, como la unión a proteínas 57 y como azúcar reductor que provoca la glicación. 164 Se demostró que una solución de d -galactosa 220 mM es un CPA casi tan efectivo como el DMSO al 5 % para las células hepáticas embrionarias humanas (y sustancialmente mejor que la d -glucosa), 165 pero la galactosa es más glicosiladora que la glucosa. 166
Los monosacáridos pueden disolverse en soluciones de CPA más fácilmente y vitrificarse en concentraciones más bajas que los disacáridos, 167 pero debido a su capacidad de glicación, la exposición de los monosacáridos a las proteínas debe ser breve y a baja temperatura. La sacarosa se considera un cosmotropo. 148 La sacarosa se utiliza como CPA extracelular para la vitrificación de embriones y ovocitos. 167 Pero en condiciones ácidas, la sacarosa es mucho más vulnerable a la hidrólisis en sus monosacáridos de azúcar reductores que el disacárido trehalosa. 168
La trehalosa es un disacárido soluble no reductor de las moléculas de glucosa. La trehalosa se sintetiza intracelularmente a partir de glucosa en organismos que sufren deshidratación. La trehalosa puede reemplazar el agua "ligada" que rodea a las macromoléculas y "hidratar" de manera protectora esas macromoléculas al sustituir el agua. 169 Para muchos organismos anhidrobióticos, la trehalosa puede constituir hasta el 20% del peso seco. 170 La fuerza de los enlaces de hidrógeno es menor para los azúcares con una temperatura de transición vítrea más alta. 186
La carga de trehalosa en fibroblastos y queratinocitos mediante la permeabilización reversible de las membranas celulares permitió que la mayoría de esas células sobrevivieran a la crioconservación. 171 La microinyección se ha utilizado para introducir trehalosa en ovocitos humanos, lo que mejora la criopreservación. 172 Cuando se combinó con DMSO 0,5 M, la trehalosa 0,5 M microinyectada en ovocitos de ratón dio como resultado una criosupervivencia excelente y una descendencia sana (presumiblemente porque la trehalosa sola no entraría en orgánulos como las mitocondrias y el retículo endoplásmico). 173 Los plásmidos que contienen el transportador de trehalosa TRET1 de larvas de quironómidos africanos se transfectaron en células de ovario de hámster chino, lo que resultó en un aumento de siete veces en la absorción de trehalosa. 174La terapia génica podría permitir la síntesis de trehalosa u otros CPA no penetrantes dentro de las células.
Los canales de iones artificiales y los nanotubos en las membranas celulares podrían ser un medio para obtener grandes moléculas vitrificantes no tóxicas que normalmente no penetran en las células y tejidos para la vitrificación intracelular. 175–178 Se podrían usar detergentes para el mismo propósito. 179 Debido a que los enlaces de hidrógeno son mucho más fuertes en un ambiente no polar que en un microambiente polar 134 y los enlaces de hidrógeno entre las moléculas de agua pueden volverse hasta seis veces más fuertes en un medio ácido o básico, 135 es posible controlar la toxicidad del CPA ajustando el pH o la polaridad del microambiente.
Los corazones, riñones, páncreas e hígados trasplantables pueden conservarse hipotérmicamente reemplazando la sangre en los vasos sanguíneos con gas frío en lugar de líquido frío. 180 Arigos Biomedical, Inc. ha utilizado gas helio frío para enfriar un riñón de cerdo a -180 °C sin fracturas, y la empresa cree que el uso de 20 atmósferas de presión podría permitir velocidades de enfriamiento 100 veces más rápidas. 181 Tales tasas de enfriamiento rápido podrían reducir el tiempo de exposición de CPA, reduciendo así la toxicidad siempre que se pueda evitar el daño debido al choque por frío y la deshidratación de las células endoteliales.
Reversión de la toxicidad de CPA
Si la toxicidad del CPA durante la criopreservación de órganos, tejidos o células hace que se liberen caspasas, proteasas o quinasas, lo que lleva a la apoptosis, se podrían aplicar intervenciones para revertir estos procesos. 182 Los inhibidores de caspasa se han utilizado para bloquear la apoptosis en células hematopoyéticas crioconservadas recalentadas desde temperaturas criogénicas. 183 Las formas menores de toxicidad por CPA podrían revertirse mediante modificaciones epigenéticas. Se han analizado los cambios en la expresión génica asociados con el daño por frío, 117 y esos cambios podrían deberse a la epigenética. Se han validado sistemas informáticos de descubrimiento de fármacos que alteran el metabolismo a un estado saludable, 184 y dichos sistemas podrían aplicarse a la disfunción metabólica inducida por los CPA.
Observaciones finales
Los intentos de explicar la toxicidad del CPA son urgentes y loables. La toxicidad de CPA debe entenderse si se va a reducir por medios distintos al ensayo y error. Para comprender la toxicidad del CPA, es necesario comprender qué macromoléculas u orgánulos se dañan químicamente y cómo se dañan. Varias células o tejidos deben exponerse a varios CPA seguidos de un examen de esas células o tejidos para detectar daños en el ADN, proteínas, mitocondrias, etc. Luego, se debe hacer un esfuerzo para determinar los mecanismos moleculares que causaron el daño.
Si los CPA individuales pueden neutralizar a otros CPA individuales, se debe determinar el mecanismo de esta neutralización. Si el daño por deshidratación es el mecanismo de la toxicidad no específica de CPA, esto debe demostrarse. La microscopía electrónica podría complementar potencialmente los ensayos de daño de macromoléculas y orgánulos. Sin un análisis exacto del daño molecular, las explicaciones de la toxicidad del CPA solo pueden ser especulaciones.
Declaración de divulgación del autor
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