Un resumen de los primeros seminarios de 21CM

 

NOTAS INTRODUCTORIAS

El 8 de noviembre de 1998, 21st Century Medicine (21CM) realizó su primer Seminario para presentar los avances en investigación criobiológica que se han logrado en los primeros años de funcionamiento. Charles Platt, presidente de la Fundación CryoCare y periodista profesional, escribió un resumen bastante completo de las presentaciones de los Seminarios 21CM. Ese resumen ha sido publicado en CRYOCARE UPDATE, la edición del primer trimestre de 1999 de la revista CRYONICS de Alcor y la edición de enero/febrero de 1999 de THE IMMORTALIST del Cryonics Institute. La American Cryonics Society ha publicado el artículo en la web en www.AmericanCryonics.org. La única otra reseña del Seminario fue un breve artículo en la edición del cuarto trimestre de 1998 de THE VENTURIST (disponible de Mike Perry en mike@alcor.org).

Creo que hay algo que ganar al tener otro punto de vista (¡el mío!) y otro explicador (¡yo!). He descrito la química con más detalle que las otras revisiones y he agregado algunas especulaciones propias. También discuto las implicaciones para la criónica . Aunque asistí a los Seminarios en persona, estoy basando esta revisión en una cuidadosa visualización de las cintas de video realizadas en la conferencia.

AVANCES REVOLUCIONARIOS EN CRIOBIOLOGÍA

(presentaciones de Gregory M. Fahy, PhD y Brian Wowk, PhD)

Brian Wowk comenzó las presentaciones describiendo una búsqueda en 21CM de nuevos agentes crioprotectores (CPA), es decir, sustancias químicas que hacen que el agua se vitrifique (enfríe hasta convertirse en un sólido vítreo) en lugar de formar cristales de hielo al bajar las temperaturas bajo cero. La estrategia de búsqueda se basa en la idea de agregar grupos metoxilo a los CPA convencionales. Los CPA convencionales que Brian nombró fueron glicerol (ampliamente utilizado para congelar sangre y esperma, y ​​el CPA más comúnmente utilizado para propósitos de criónica), etilenglicol (el aditivo más comúnmente utilizado en anticongelantes para automóviles) y propilenglicol (utilizado para minimizar los cristales de hielo en helado). La estructura química de estos tres compuestos son:

Los investigadores de 21CM reemplazaron los grupos hidroxilo (-OH) con grupos metoxilo (-OCH ₃ ) para producir compuestos que eran menos viscosos (autointeracción reducida y mayor interacción con el agua) y tenían más permeabilidad (más penetración a través de las membranas celulares debido a una mayor miscibilidad del aceite). ). Al sustituir un metoxilo por un hidroxilo se crea un éter (molécula con un oxígeno entre dos carbonos). Un grupo hidroxilo menos reduce los enlaces de hidrógeno entre los crioprotectores, pero el oxígeno del éter aún puede formar enlaces de hidrógeno con el agua. Brian resumió los resultados en la siguiente tabla, que compara los crioprotectores originales con los derivados del metoxilo:

Crioprotectores convencionales y metoxi derivados

COMPUESTO	VISCOSIDAD (centipoises@20ºC)	PERMEANCIA (glóbulos rojos@20ºC)
etilenglicol	25	3.4
2-metoxietanol (2-ME)	1.7	12
1,2-dimetoxietano (1,2-DME)	0.5	--
propilenglicol	60	1.8
1-metoxi-2-propanol (1M-2P)	1.7	--
glicerol	1400	0.6
3-metoxi-1,2-propanodiol (3-MPD)	80	1.0
1,3-dimetoxi-2-propanol (1,3-DP)	--	--

Las entradas "--" en la tabla representan "datos no disponibles", aunque Brian comentó que el 1-metoxi-2-propanol es mucho más permeable que el propilenglicol. Además, no se dispone de datos precisos para el derivado de glicerol 1,3-dimetoxi-2-propanol, pero se considera que es menos viscoso.

Brian mostró un gráfico que comparaba la salida de un calorímetro diferencial de barrido (DSF) para 45 % de glicerol y 45 % de 3-metoxi-1,2-propanodiol (3-MPD). (Un DSF mide el flujo de calor dentro y fuera de pequeñas muestras de crioprotector en solución de agua a varias temperaturas). Enfriando a 20ºC por minuto, se observó una fuerte caída en el flujo de calor a -60ºC para el glicerol debido a la formación de hielo, lo que no se observó con 3-MPD. Brian estimó aproximadamente un 30 % de formación de hielo en la solución de glicerol en comparación con menos del 1 % de hielo en el 3-MPD. La única caída en la curva DSF para 3-MPD se observó alrededor de -110ºC, asociada con la temperatura de transición vítrea (temperatura de formación de un sólido vítreo).

Brian dijo que, como regla general, un derivado metoxilado se vitrificará a una concentración aproximadamente un 5 % menor que el CPA convencional correspondiente. Como otra regla general, dijo que la temperatura de transición vítrea tiende a ser aproximadamente 12ºC más alta por grupo metoxilo que el CPA convencional. Brian sugirió que las temperaturas de vitrificación más altas podrían permitir el almacenamiento a largo plazo a temperaturas más altas a un costo menor, al tiempo que se reduce el agrietamiento que se observa a menudo a temperaturas más bajas. La temperatura de vidrio más alta que el grupo 21CM ha encontrado hasta ahora es de -85 ºC, pero Brian todavía tiene esperanzas de poder lograr la vitrificación por encima de la temperatura del hielo seco (-79 ºC).

Brian dijo que la hidrofobicidad (lipofilicidad) de los compuestos metoxilados está asociada con su alta toxicidad. Esto puede deberse a la disolución de las membranas celulares. Pero Brian dijo que esta toxicidad se puede aliviar mezclando los compuestos metoxilados con otros agentes. Al medir la viabilidad por la capacidad de las células para bombear iones (la relación K+/Na+), Brian comparó una mezcla 50-50 de etilenglicol y 3-MPD con el compuesto VS41A de Greg Fahy (la solución de vitrificación menos tóxica conocida en la última década) para rebanadas de riñón. Tanto la mezcla 50-50 como el VS41A mostraron una reducción de viabilidad de alrededor del 60 % en comparación con el control (es decir, sin CPA). Al reemplazar el propilenglicol en VS41A con 3-MPD, lograron una viabilidad que en realidad fue ligeramente mayor que la observada para VS41A.

[Un artículo revisado por pares que describe los efectos de la metoxilación por el Dr. Brian Wowk, et.al. apareció en CRYOBIOLOGY 39(3):215-222 (1999)] (El trabajo también fue patentado -- Patente 5,952,168 ).

Luego, el Dr. Greg Fahy subió al escenario para hablar sobre su trabajo para mejorar su solución VS41A. Su solución VS4 es una mezcla equimolar de DMSO y formamida [14 % (p/v) para cada uno de DMSO y formamida, conocida como "D(1)F", donde el DMSO neutraliza la toxicidad de la formamida] con aproximadamente un 11 % (p/v) se añadió propilenglicol y aproximadamente 10% (p/v) de coloide para hacer que la concentración crioprotectora total fuera del 49% peso/volumen. VS4 no es muy tóxico, pero solo vitrificará a 1000 atmósferas de presión. VS41A es una mezcla de los mismos crioprotectores que se encuentran en VS4, pero con proporciones relativas, pero con aproximadamente un 17 % (p/v) de propilenglicol para que la concentración total de crioprotectores sea de aproximadamente un 55 % en peso/volumen. A diferencia de VS4, VS41A vitrificará a presión (atmosférica) normal (el sufijo "1A" se refiere a "1 atmósfera"). pero está empujando los bordes de la toxicidad. No obstante, VS41A ha sido la solución de vitrificación menos tóxica conocida por el hombre durante toda una década.

Greg dijo que la mayor permeabilidad de los compuestos metoxilados contribuye a su menor toxicidad porque con una mayor permeabilidad se reduce el tiempo de exposición necesario para lograr la vitrificación. Pero los compuestos metoxilados fueron incluso menos tóxicos cuando se expusieron durante la misma cantidad de tiempo.

Greg dijo que el problema de diseñar un protocolo práctico de vitrificación implica no solo elegir una solución de vitrificación, sino también un vehículo. Revisó las soluciones de vitrificación utilizadas actualmente por los criobiólogos y las dividió en 3 categorías:

    (1) CPA simple con o sin polímero

    (2) CPA simple + azúcar con o sin polímero

    (3) múltiples CPA con o sin otros aditivos

(Los polímeros se refieren a sustancias como polivinilpirrolidona, dextrano, alginato, etc.)

Greg concluyó que estas soluciones eran casi todas mezclas de brebaje de brujas que no se basaban en un diseño racional. Mostró los resultados de un experimento que realizó para evaluar la viabilidad de 13 CPA. Concluyó que existen dos tipos de soluciones crioprotectoras: las que contienen una amida más DMSO (como VS4 y VS41A) y las que no. No había motivos para entender por qué una solución en particular resulta más viable que otra. Luego intentó correlacionar la viabilidad con la tendencia de un CPA a desnaturalizar la proteína, pero sus resultados no tenían sentido. También trató de correlacionar la viabilidad con la concentración de CPA y vio poca variación en la viabilidad en amplios rangos de concentración. Pero cuando usó un nuevo método para medir la concentración de CPA (que él llama " qv*") fue capaz de producir gráficos de línea recta para soluciones de amida y no amida (las soluciones de amida son un poco menos tóxicas). En el momento de la presentación, Greg tenía una patente pendiente sobre qv* (posteriormente recibió la patente -- patente 6.395.467 ).

Al usar qv* , Greg pudo distinguir la toxicidad específica de la toxicidad no específica y, por lo tanto, pudo minimizar las toxicidades específicas. Basado en qv*concepto Greg generó una solución de vitrificación a la que llamó VX. La solución VX mostró una viabilidad del 85 % del control, que es significativamente mejor que la viabilidad del 60 % de VS41A (que durante 10 años había sido la solución de vitrificación menos tóxica conocida). La viabilidad de VX fue comparable a la de VS4, pero VS4 no vitrifica (excepto a 1000 atmósferas de presión), mientras que VX está en el umbral de la vitrificabilidad. Al modificar VX para obtener una solución de vitrificación completa, encontró otro compuesto, "VXD", que da como resultado la misma viabilidad (proporción K+/Na+) que VX. Modificando aún más VXD, encontró mezclas más prometedoras. Dijo que ahora tiene alrededor de 15 soluciones para examinar, todas las cuales parecen ser superiores a su anterior "campeón mundial", VS41A.

El medio estándar para evaluar la vitrificabilidad de CPA es medir pequeñas cantidades de CPA. Pero los resultados de los ensayos de cantidades pequeñas no siempre aumentan de escala. Por ejemplo, una solución de etilenglicol al 56 % se vitrifica bien en un tubo de ensayo, pero para volúmenes más grandes, como 250 ml en un matraz Erlenmeyer, se ven cristales de hielo.

Como ha sido revelado por la Patente 6,395,467 , q* se refiere a

                                    moles de agua
  q*   =   -------------------------------------------- --------
               moles de grupos polares en crioprotector penetrante

y qv* se refiere a q* a una concentración necesaria para vitrificar 5-10 ml de solución a una velocidad de enfriamiento de unos 10ºC por minuto ( C _v ). Cuando los crioprotectores penetrantes se trazan en sus concentraciones necesarias para vitrificar, se observa una buena correlación entre qv* y viabilidad.

El concepto qv* resultó en un avance conceptual que mejoró enormemente las formulaciones de crioprotectores, lo que permitió a los pacientes con neurocriónica vitrificarse con menos del 0,2 % de formación de hielo. El concepto qv* ha llevado a 21CM a formular cócteles crioprotectores con el crioprotector penetrante (p. ej., etilenglicol) seleccionado como el que tiene los enlaces de hidrógeno más débiles cuando el crioprotector está en una concentración apenas adecuada para vitrificar ( C _v). El uso de crioprotectores más débiles significa que se necesita un mayor volumen de crioprotector y que se desplaza más agua. Pero el enlace de hidrógeno más débil permite que el agua que queda aún realice funciones vitales de hidratación celular que aparentemente no ocurrían con los crioprotectores más fuertes, lo que lleva a la toxicidad.

Para ayudar en la vitrificación, Greg recurrió a aditivos que podrían inhibir la formación de cristales de hielo siguiendo el patrón de sustancias que se encuentran en la naturaleza. Los compuestos que bloquean el crecimiento de los cristales de hielo lo hacen por medios bastante distintos del proceso físico de vitrificación y, por lo general, a temperaturas más altas. Las proteínas que bloquean el hielo se adhieren a los "nucleadores", núcleos de hielo incipientes u otras moléculas de forma similar que pueden actuar como núcleos para que crezcan los cristales de hielo. Los peces polares tienen proteínas que inhiben el crecimiento de cristales de hielo, lo que les permite vivir por debajo del punto de congelación.

Greg había probado VS4 con un 5 % de proteína anticongelante con la esperanza de lograr una vitrificación comparable a VS41A, pero sin mucho éxito. Pero al usar otra solución de vehículo (a la que llamó "vehículo 1"), redujo la formación de hielo en una solución VS4 por un factor de mil, usando solo el 1% de proteína anticongelante de pescado. El aumento de la velocidad de enfriamiento de 1ºC/minuto a 3ºC/minuto prácticamente eliminó la formación de hielo. Usando otro vehículo ("vehículo 2"), pudo eliminar la formación de hielo con VS4 más 1% de proteína anticongelante de escarabajo con una velocidad de enfriamiento de solo 1ºC/minuto (una velocidad alcanzable en el enfriamiento de riñones humanos). Además, Brian informó que menos del 1 % de proteína anticongelante de escarabajo en VS4 también previene la formación de cristales de hielo al recalentarsea 1ºC/minuto (frente a los 200ºC/minuto necesarios sin la proteína). El Dr. Fahy ha visto la formación de cristales de hielo en el recalentamiento de soluciones vitrificadas como la principal barrera para la vitrificación de órganos.

Luego, Brian regresó al podio para describir su trabajo para encontrar bloqueadores de hielo sintéticos sin proteínas que podrían usarse para realizar las funciones de las proteínas anticongelantes. Explicó que los bloqueadores de hielo sintéticos serían más robustos que las proteínas y menos propensos a ser sensibles al pH o producir reacciones alérgicas. Además, la proteína del escarabajo tiene un precio prohibitivo de 1.000 dólares el miligramo.

El hielo tiene dos ejes de crecimiento de cristal, un "eje c" vertical ("eje z", en coordenadas cartesianas) y dos "ejes a" horizontales ("eje x" y "eje y" en coordenadas cartesianas) . El crecimiento de cristales de hielo a lo largo de los ejes a ocurre más a temperaturas más altas, mientras que el crecimiento del eje c ocurre más a temperaturas más bajas. La mayoría de las proteínas anticongelantes naturales inhiben el crecimiento del eje a sin inhibir el crecimiento del eje c. Brian logró desarrollar la serie de bloqueadores de hielo "21CM-X". A diferencia de los bloqueadores de hielo naturales, los compuestos 21CM-X muestran la mayor actividad contra el crecimiento del eje c que ocurre a temperaturas más bajas (una propiedad valiosa para ayudar en la vitrificación y la desvitrificación). Los bloqueadores de hielo son de baja toxicidad y son mil veces menos costosos que la proteína anticongelante de escarabajo.

Aunque se requiere un 50 % de DMSO en un tubo de ensayo para evitar la formación de hielo con una velocidad de enfriamiento de 7 °C/minuto, agregar un 1 % de bloqueador de hielo "X1" redujo la concentración requerida de DMSO al 47 %. Aunque el 3% no parece una gran reducción, puede marcar una gran diferencia en la reducción de la toxicidad.

Las soluciones que vitrificarán sin congelarse a menudo forman cristales de hielo "como locos" (palabras de Brian) al recalentarse (desvitrificación). Pero los bloqueadores de hielo parecen ser tan efectivos para prevenir la formación de hielo en la desvitrificación como en el enfriamiento. Estos efectos se han visto con todos los CPA probados, no solo con DMSO. Además, los efectos de X1 no se pierden al aumentar la escala hasta volúmenes de 250 ml.

[Un artículo revisado por pares que describe los efectos de los bloqueadores de hielo por el Dr. Brian Wowk, et.al. apareció en CRIOBIOLOGÍA 40:228-236 (2000)]

CRIOCONSERVACIÓN MEJORADA DE CÉLULAS, TEJIDOS Y ÓRGANOS

(presentación de Gregory M. Fahy, PhD)

El Dr. Fahy comenzó su presentación mostrando una fotografía de un riñón que había vitrificado en 1983. Aunque ha sido posible vitrificar un riñón durante 15 años, no ha sido posible vitrificar riñones sin pérdida de viabilidad, o evitar la formación de hielo. formación tras el recalentamiento (desvitrificación).

Greg revisó las razones por las que sería deseable criopreservar órganos. El 95 % de los riñones se adaptan mal a sus receptores, y la compatibilidad de hígados y corazones es aún peor. La capacidad de almacenar órganos en un banco incluso durante unas pocas semanas daría tiempo para emparejar los órganos con los receptores. Y los cirujanos de trasplante no se verían obligados a trabajar en momentos y condiciones inconvenientes para aprovechar la disponibilidad de órganos.

Hablando del mercado potencial, sugirió que 21CM posiblemente podría ganar $ 10,000 por órgano de aproximadamente 20,000 trasplantes de órganos vitales por año ($ 200 millones). Agregar trasplantes de órganos no vitales (extremidades, esófago, estómago, senos, etc.) podría generar otros $ 300 millones. Los órganos y tejidos artificiales (sin límite de suministro) podrían generar otros mil millones de dólares. Y los xenógrafos (trasplante de órganos animales a humanos) podrían traer más millones.

21CM está concentrando sus esfuerzos inicialmente en los riñones porque los riñones han sido los más estudiados y son los que están más cerca de ser criopreservados. Es fácil trasplantar riñones. Los riñones son actualmente el órgano trasplantado con mayor frecuencia. Y una falla en el trasplante no resulta en la muerte del paciente, ya que el paciente puede mantenerse con vida con máquinas de diálisis.

En 1994, justo antes de que Greg y su equipo dejaran la Cruz Roja, demostró que podía perfundir riñones a -46 ºC y que los riñones sobrevivieran el 50 % de las veces. Dado que el daño por enfriamiento se maximiza a -46 °C, Greg supone que un mayor enfriamiento hasta la temperatura de transición vítrea no debería causar más lesiones. ("Daño por enfriamiento" es un efecto dañino misterioso que aparentemente se suma a la toxicidad del CPA y la nucleación de cristales de hielo). Pero se requieren tasas de recalentamiento de 50ºC a 100ºC/minuto para evitar la formación de hielo con VS41A. Los miembros de la nueva familia VX de CPA pueden enfriarse a 5 ºC por minuto y recalentarse a 10 ºC por minuto (incluso sin bloqueador de hielo) sin pérdida de viabilidad. Greg mostró una mejora del 50 % en la viabilidad con respecto a VS41A en el recalentamiento con la serie VX.

Greg comparó las soluciones de vehículos EC, RPS2 y MHP2. EC se perfunde más fácilmente, pero no es tan compatible con la viabilidad como RPS2. RPS2 es bueno para rebanadas, pero EC es mejor para riñones enteros. MHP2 es tan no tóxico en rodajas de riñón como RPS2, se puede usar para perfundir riñones completos como EC, es compatible con soluciones de vitrificación y X1, y 21CM tiene una patente.

Greg habló de los contratos que 21CM ha negociado/está negociando para la investigación cooperativa con un laboratorio universitario de preservación cardíaca y un laboratorio de trasplante de hígado. 21CM conservará las patentes de sus compuestos patentados en esta investigación. El trabajo de preservación del riñón será realizado por 21CM en la División de Criobiología.

En un video, Greg usó un criomicroscopio para demostrar la recristalización en el recalentamiento. El criomicroscopio utiliza vapor de nitrógeno líquido regulado por bombas controladas por programa que pueden crear las temperaturas deseadas bajo el microscopio. Las imágenes van a un monitor de video, que se puede grabar (y cuantificar). Al recalentarse, los cristales de hielo normalmente se reestructuran en cristales de hielo más grandes, lo que puede ser extremadamente dañino para los tejidos. Pero los bloqueadores de hielo evitan esta reestructuración de cristales, evitando así el daño tisular.

Volviendo al tema de la rentabilidad, Greg habló sobre los espermatozoides, las córneas, los equivalentes de piel y la conservación celular de rutina. Solo el 10% de los donantes humanos tienen esperma que se puede criopreservar. El esperma humano ya es un mercado de 20 millones de dólares, pero con CPA mejorados, el mercado potencial podría ser mucho mayor. El esperma humano normalmente se conserva en glicerol un molar, pero Greg mostró un video de esperma congelado en una solución VX 2,5 molar con una mejora considerable.

Actualmente, se realizan alrededor de 50.000 trasplantes de córnea al año, pero si se pudieran almacenar las córneas, el número sería al menos 5 veces mayor. Cuando la mayor parte de la córnea se expone a VS41A durante el tiempo suficiente para provocar la vitrificación, se produce una pérdida celular del 21 %, lo que es inaceptable. Pero Greg cree que los nuevos compuestos son mucho más permeables y mucho menos tóxicos, por lo que las posibilidades de lograr la vitrificación en un futuro próximo son muy buenas.

AVANCES EN RESUCITACIÓN E INDUCCIÓN NO INVASIVA DE HIPOTERMIA PROFUNDA

(presentaciones de Mike Darwin)

Mike Darwin comenzó su presentación diciendo que su objetivo personal es lograr la reanimación después de 30 minutos de isquemia normotérmica (falta de circulación a temperatura ambiente). El límite absoluto teórico es de 60 minutos. Mostró un video de un perro que había estado sujeto a 17 minutos de isquemia normotérmica, y luego resucitado a una salud aparentemente perfecta.

Al enfatizar la importancia de su trabajo, Mike dijo que el paro cardíaco repentino (muerte arrítmica) representa el 54,8 % de todas las muertes cardiovasculares y el 26 % del total de muertes en los Estados Unidos. Aproximadamente el 30% de las víctimas son menores de 50 años. Describió la RCP como peor que inútil si retrasa el tiempo de soporte vital cardíaco avanzado (ACLS).

Mike revisó los medicamentos que se utilizan actualmente en los protocolos de ACLS y señaló que todos están dirigidos al sistema cardiovascular (epinefrina, lidocaína, atropina, etc.). No se incluyen fármacos para la lesión por isquemia-reperfusión. Sin embargo, el resultado clínico actual después de 4 a 6 minutos de paro cardíaco normotérmico es de aproximadamente un 20 % de supervivencia, con menos del 1 % del total libre de cualquier déficit neurológico. Los déficits son principalmente el resultado del daño neurológico causado cuando se reinicia la circulación (lesión por reperfusión).

A través del uso de dilución de sangre, enfriamiento rápido, tratamientos farmacológicos multimodales, una máquina de circulación extracorpórea y apoyo metabólico (pH, gases en sangre, glucosa, etc.), Mike ha recuperado repetidamente perros de 15 a 17 minutos de isquemia (una prueba no oficial). récord mundial) en experimentos que cuestan $ 10- $ 15,000 cada uno. Mike usa perros porque sus lesiones neurológicas se notarían fácilmente y porque la respuesta de un perro a la isquemia cerebral es muy similar a la de un ser humano. Por el contrario, los monos que viven en los árboles han evolucionado para recuperarse mucho más fácilmente de la isquemia cerebral, hasta 15 minutos sin intervención.

Mike pone a sus perros en circulación artificial de derivación cardíaca para controlar tanto el metabolismo como la temperatura. Su protocolo incluye 22 fármacos, que reducen la viscosidad sanguínea, controlan el pH, reducen los radicales libres, inhiben la excitotoxicidad y antagonizan el calcio (entre otras acciones). Para hacer frente a la disminución de la capacitancia vascular, debe drenar inicialmente aproximadamente la mitad del volumen de sangre.

Al analizar las limitaciones de su protocolo, Mike mencionó la toxicidad hepática debida a los medicamentos. Justificó la necesidad del pretratamiento con heparina diciendo que la coagulación probablemente no es un factor muy importante en el daño isquémico y que los catéteres ligados con heparina son muy caros. El uso de barbitúricos como anestésicos puede brindar cierta protección, pero probablemente no mucha. Finalmente, los experimentos podrían beneficiarse de medios sistemáticos y cuantitativos para comparar el estado fisiológico y neurológico antes y después de la aplicación del trauma y el protocolo. Las perspectivas de aprobación de la FDA son malas, porque la FDA rara vez aprueba cócteles de múltiples medicamentos. También es poco probable que la FDA apruebe un sistema automatizado de administración de medicamentos multimodal.

La segunda mitad de la presentación de Mike trató sobre los medios para bajar la temperatura corporal. Poner a alguien en un baño de agua helada agitada es uno de los métodos contemporáneos más efectivos, y el uso de la circulación extracorpórea es otro. Un bypass se puede hacer en 15 minutos.

Los problemas con el enfriamiento externo incluyen el hecho de que las tasas de enfriamiento no pueden exceder los 0,2 ºC/minuto y que el enfriamiento externo hace que los vasos sanguíneos se contraigan (cortando el flujo sanguíneo). El bypass cardiopulmonar es invasivo, requiere anticoagulación, es costoso y técnicamente exigente, y no es portátil. El lavado peritoneal/pleural no es mucho mejor que el enfriamiento externo.

Sobre el anterior Mike tuvo la idea de usar ventilación líquida total con perfluorocarbonos en los pulmones como un medio de enfriamiento rápido. Cuando solicitó una patente, descubrió que alguien más ya había patentado la idea. Mike experimentó con la ventilación líquida y descubrió que la ventilación líquida parcial (PLV) tiene ventajas sobre la ventilación líquida total. Pudo obtener una caída de temperatura de 1.5º-2ºC dentro de los 180 segundos de la aplicación inicial. El uso de PLV para el recalentamiento es más problemático, porque se forman burbujas de nitrógeno en la sangre ("las curvas") con diferencias de temperatura superiores a 5ºC.

La ventilación líquida total en realidad reduce el intercambio de calor debido a los problemas asociados con el movimiento de fluido viscoso dentro y fuera del pulmón. Con PLV, el perfluorocarbono frío (2 ºC) se puede soplar y succionar a un ritmo bastante rápido. El intercambio de dióxido de carbono mejora mucho con este método y también se mantiene una buena oxigenación. Una tasa de enfriamiento constante de 0,36 ºC/minuto (la mitad de la tasa máxima alcanzable con circulación extracorpórea).

Mike dijo que las áreas del cuerpo directamente afectadas por el perfluorocarbono (vías respiratorias pequeñas, volumen sanguíneo, parénquima pulmonar) representan el 17 % de la capacidad calorífica corporal total, mientras que el 72 % de la capacidad calorífica total se encuentra en los tejidos centrales bien perfundidos (cerebro , hígado, etc.) y el 11% está en el tejido mal perfundido (contenido intestinal, hueso, etc.). Por esta razón hay oscilación de temperatura durante PLV y hay rebote.

Mike imagina un dispositivo portátil que podría entregar PLV en el campo sin mucha dificultad. Y cree que los ensayos clínicos podrían comenzar tan pronto como en 3 años.

(El trabajo fue patentado como parte de la patente del Dr. Wowk sobre compuestos alcoxilados - Patente 5,952,168 ).

¿CUÁNDO PODEMOS LOGRAR LA ANIMACIÓN SUSPENDIDA?

(más presentaciones, panel de discusión y preguntas)

El panel comenzó con Brian Wowk repasando el estado actual del arte en criónica, que describió como una perfusión de glicerol 7,0-7,5 molar con enfriamiento externo de 0,1ºC/minuto. Brian mostró micrografías electrónicas del cerebro de un perro que había sido sometido al protocolo de glicerol 7,5 molar-0,1ºC/minuto. El daño extenso era evidente.

Enfriar una solución de glicerol 7,5 molar en un matraz de 250 mL a 0,1ºC/minuto da como resultado una solución blanca calcárea compuesta por millones de cristales de hielo. Agregar un 1 % de bloqueador de hielo (X1) a glicerol 7,5 molar da como resultado una solución que es aproximadamente 90 % vítrea para una tasa de enfriamiento de 0,1 ºC, y un 2 % de bloqueador de hielo da como resultado una vitrificación completa.

La vitrificación completa se puede lograr para glicerol 7,3 molar con bloqueador de hielo X1 al 1 % aumentando la velocidad de enfriamiento a 0,5 ºC/minuto. Tal velocidad de enfriamiento se puede lograr en criónica mediante el uso de perfusión de fluorocarbono. Con fluorocarbono, se pueden lograr tasas de enfriamiento de 9 ºC/minuto a 20 ºC y 1 ºC/minuto aún se puede lograr a temperaturas tan bajas como -110 ºC. Los fluorocarbonos no se mezclan ni con agua ni con aceite, y permanecen líquidos a temperaturas muy bajas.

El bloqueador de hielo X1 no se difunde en las células, lo que podría limitar su eficacia. Pero Brian mencionó que esto es motivo de controversia, ya que la mayor parte de la congelación ocurre en el espacio extracelular, y las proteínas intracelulares existentes pueden ser adecuadas para prevenir el daño dentro de las células. El aumento de la concentración de X1 por encima del 2 % da como resultado problemas de viscosidad que serían mucho menos graves en otros bloqueadores de hielo 21CM-X.

Dado que el glicerol 7 molar es tóxico para las células, tiene más sentido perfundir con soluciones como VX en lugar de glicerol. Greg Fahy describió experimentos que realizó recientemente en cerebros de conejos. En el primer experimento usó perfluorocarbonos y la mínima cantidad de crioprotector requerido. Las micrografías electrónicas mostraron una estructura cerebral intacta: axones, sinapsis, tejido pericapilar, etc. Sin embargo, se observaron algunas áreas dañadas. En el segundo conejo, se usó una concentración más alta de CPA (9,5 molar) sin indicios de congelación al enfriar o calentar. Las micrografías electrónicas mostraron una excelente conservación de la estructura neural sin evidencia de daño, incluso en el área CA1 del cerebro, que es el área más sensible al daño isquémico.

El panel discutió una variedad de problemas. La barrera hematoencefálica parece un obstáculo para los crioprotectores, pero esto posiblemente podría resolverse implantando un catéter directamente en el líquido cefalorraquídeo. Ciertos órganos como los huesos y los ojos pueden ser particularmente difíciles de perfundir, lo que significa que podrían pasar décadas después de que se haya logrado la criopreservación de órganos (riñón, corazón, cerebro, hígado) para lograr la animación suspendida completa de una persona completa. La eliminación de perfluorocarbono también podría ser un problema difícil (aunque Hugh Hixon sugirió que el tetrafluoruro de carbono, que se evapora fácilmente, podría funcionar para el lavado).

EXPLICACIONES ADICIONALES Y ESPECULACIONES

(comentarios de Ben Best)

Las presentaciones me impresionaron cuánta brujería y cuán poca ciencia se ha invertido en el estudio de los agentes crioprotectores (CPA). Esto podría ser comprensible a la luz del hecho de que la mayoría de los criobiólogos son, de hecho, biólogos. Sospecho que se podría lograr mucho con un estudio completo de la física de la química de los CPA.

Pero teniendo en cuenta que los otros dos crioprotectores convencionales de los que habló Brian (propilenglicol y etilenglicol) son considerablemente menos viscosos y más permeables que el glicerol, no sabía por qué el glicerol ha sido el CPA elegido por los crionicistas. Le pregunté a Brian y admitió que no lo sabía con certeza, pero especuló que debido a que el edema era tan común entre los primeros pacientes de criónica y debido a que el glicerol es tan deshidratante, se encontró que el glicerol en la práctica resulta en menos problemas de edema. Pero esto habría sido irrelevante después de que Jerry Leaf y Mike Darwin comenzaran a usar HES (HydroxyEthyl Starch) como coloide para prevenir el edema en pacientes con criónica comprometida con isquemia. La toxicidad del etilenglicol a 38ºC (por metabolismo a ácido oxálico) no se produce a 0ºC.

El cloruro de sodio (sal de mesa) forma una estructura cristalina con un alto punto de fusión (800ºC) que se disuelve fácilmente en agua. Es la naturaleza polar del agua lo que le permite separar los iones de sodio y cloro. Sospecho que la capacidad de vitrificar está relacionada con la capacidad de las sustancias para entrometerse entre las moléculas de agua y formar puentes de hidrógeno con ellas. Para propósitos de preservación de órganos, un CPA debe combinar baja viscosidad, polaridad, lipofilia y bajo peso molecular.

La capacidad de un solvente para separar cargas se mide por una propiedad física conocida como constante dialéctica . Consultando el MANUAL DE QUÍMICA Y FÍSICA, observo que los CPA suelen tener una constante dieléctrica alta:

CPA con alta constante dialéctica

COMPUESTO	Constante dialéctica a cerca de 20ºC
formamida	111
Agua	80.1
Dimetilsulfóxido (DMSO)	47.2
Glicerol	46.5
Etilenglicol	41.4
N,N-dimetilformamida (DMF)	38
Propilenglicol	27.3
Etanol	25.3
2-metoxietanol (2-ME)	17.2
1,2-dimetoxietano (1,2-DME)	7.3

 

Incluí etanol para mostrar el contraste con el 2-metoxietanol, que Brian había presentado como un derivado del etilenglicol. La adición de grupos metoxi parece reducir la constante dialéctica, lo que tiene sentido desde el punto de vista de su lipofilia. Dado que Brian dijo que la adición de grupos metoxi generalmente da como resultado un 5% menos de CPA para lograr la vitrificación, parecería que el efecto de la constante dialéctica es "mitigado" por otros factores. Dado que los cócteles de CPA parecen ser más efectivos que los CPA de un solo agente.

 

Comprender la física de la química de las interacciones CPA (CPA a CPA y CPA a solvente) será un gran paso más allá de la brujería. Tendría curiosidad sobre el resultado de la sustitución de un metoxi por un grupo metilo en DMF o N-metilformamida, ya que esto probablemente aumentaría los enlaces de hidrógeno.

 

Puede ser que la alta constante dialéctica de la formamida funcione junto con otras propiedades solvatantes/vitrificantes de otros CPA. Hojeé el MANUAL DE QUÍMICA Y FÍSICA para ver qué otros compuestos solvatantes de bajo peso molecular y alta constante dieléctrica parecían prometedores. Encontré lo siguiente:

 

No CPA con alta constante dialéctica

COMPUESTO	Constante dialéctica a cerca de 20ºC
N-metilformamida	189
N-metilpropanamida	170
Cianuro de hidrógeno	114.9
hidracina	51.7
acetonitrilo	36.6
2-metil-1-propanol	17.9

La N-metilpropamida puede ser demasiado grande y voluminosa, y el cianuro de hidrógeno puede ser demasiado reactivo para parecer atractivo. Pero si la mayor parte de la congelación ocurre en el espacio extracelular, algo de volumen podría no ser un gran problema. La reactividad es una función de la temperatura, por lo que si el cianuro de hidrógeno es útil, podría ser el último componente agregado a la temperatura más baja (lo que dejaría el problema de cómo eliminarlo al recalentarlo).

Las fuerzas intermoleculares entre moléculas neutras suelen ser menos del 15 % tan fuertes como los enlaces covalentes o iónicos. Mis especulaciones han puesto mucho énfasis en las fuerzas dipolo-dipolo, pero son significativas otras dos fuerzas intermoleculares entre moléculas neutras: la fuerza de dispersión de London y los enlaces de hidrógeno. Y el agua puede interactuar no solo con otras moléculas neutras (como los crioprotectores), sino también con iones no neutros (fuerzas ion-dipolo), aunque parece poco probable que se pueda obtener un gran beneficio crioprotector al reducir el punto de congelación con sal añadida ( en gran parte un efecto coligativo, aunque las sales varían mucho en la depresión del punto de congelación).

La fuerza de dispersión de London es un dipolo inducido entre moléculas grandes que están muy juntas, especialmente hidrocarburos grandes. (Las moléculas grandes no tienen un control tan estricto sobre los electrones externos, lo que hace que los dipolos temporales y espontáneos sean más fáciles de inducir). moléculas, y la interacción dipolo-dipolo representa el otro 20% (el cloro es demasiado grande para formar puentes de hidrógeno).

El enlace de hidrógeno es la fuerza intermolecular más fuerte, pero solo se ve entre el hidrógeno y los átomos electronegativos más pequeños, a saber, oxígeno, nitrógeno y flúor. En los sistemas biológicos, los enlaces de hidrógeno de oxígeno y nitrógeno normalmente serían los más relevantes. Las energías de enlace de hidrógeno están típicamente en el rango de 4 KJ/mol a 25 KJ/mol.

Lo más probable es que el enlace de hidrógeno entre las moléculas de agua y las moléculas crioprotectoras sea la clave del mecanismo de acción crioprotectora. Los oxígenos en formamida y DMSO y el nitrógeno en formamida pueden desempeñar este papel. Curiosamente, la formamida reduce la toxicidad del DMSO por algún mecanismo desconocido (el mecanismo de la toxicidad también se desconoce). [Para obtener más información sobre los agentes crioprotectores, consulte mis ensayos Vitrification in Cryonics y Perfusion & Diffusion in Cryonics Protocol .]

Reemplazar los átomos de hidrógeno con átomos de flúor en los hidrocarburos produce moléculas conocidas como fluorocarbonos . Un hidrocarburo (alcano) en el que cada átomo de hidrógeno ha sido reemplazado por un átomo de flúor se denomina perfluorocarbono . La fuerza de enlace y la estabilidad de estas moléculas es tan grande que interactúan muy poco con otras moléculas, no siendo miscibles con agua ni con aceite.

Un estudio de las energías de disociación de enlace promedio para carbono-halógeno y carbono-hidrógeno arroja algo de luz sobre las propiedades de los clorofluorocarbonos y perfluorocarbonos:

Energías de disociación de enlaces

VÍNCULO	ENERGÍA ( kilojulios/mol )
FC	439
CH	400
C-Cl	345
C-Br	272

Los clorofluorocarbonos (CFC) se hicieron populares en la refrigeración y como propulsores de aerosoles porque no son tóxicos, no son inflamables, no tienen olor ni son corrosivos. Los más utilizados fueron Freon-11 (CCl ₃ F) y Freon-12 (CCl ₂ F ₂ ) hasta que surgieron pruebas de que estas sustancias agotan el ozono atmosférico. Estos Freones tienen puntos de ebullición de -24ºC (Freón-11) y -30ºC (Freón-12). Los freones enfrían un refrigerador al evaporarse y luego se reciclan mecánicamente a líquido por la presión de un compresor.

El oxígeno elemental normalmente existe en las dos formas O ₂ y O ₃ (ozono), con solo una pequeña porción en forma de ozono. Pero esa diminuta porción juega un papel muy significativo en la estratosfera terrestre (11-48 kilómetros sobre la superficie) donde la absorción de luz ultravioleta induce la reacción: O ₃  -> O ₂  + O ^. que normalmente es el equivalente a: 2 O ₃ (ozono) -> 3 O ₂

Debido a que los CFC son tan inertes, permanecen en la atmósfera y algunos eventualmente llegan a la estratosfera. La luz ultravioleta provoca la liberación de un radical de cloro (Cl ^. ) que agota el ozono al producir un radical de óxido de cloro (ClO ^. ) y oxígeno: Cl ^.  + O3 _-  > ClO ^.  + O ₂ . El radical de óxido de cloro luego se combina con el oxígeno para regenerar el radical de cloro: ClO ^.  +O ^.  ->Cl ^.  + O ₂ . Mediante tal reacción en cadena, un solo radical de cloro de una sola molécula de CFC agotará alrededor de 4000 moléculas de ozono de la estratosfera. El resultado ha sido un mayor daño a los cultivos, la piel cáncer y daño general a las plantas y animales del mundo.

La fuerza del enlace carbono-flúor tiene mucho que ver con la razón por la cual el teflón (el nombre de Dupont para lo que es efectivamente un polímero de perfluorocarbono hecho de tetrafluoroetileno) es tan inerte y no interactúa fácilmente con otras sustancias (por lo tanto, antiadherente, resistente a la corrosión). utensilios de cocina).

Hubo algunas dudas en el Seminario 21CM sobre el posible impacto de la regulación gubernamental de las sustancias que agotan la capa de ozono sobre la disponibilidad de perfluorocarbonos. Pero a diferencia de los CFC, los perfluorocarbonos no agotan el ozono porque el enlace carbono-flúor es tan fuerte que la luz ultravioleta no libera radicales de flúor. De hecho, los hidrofluorocarbonos (HFC) se han promocionado como una alternativa a los CFC, y la mayoría de los automóviles y camiones nuevos ahora contienen acondicionadores de aire que funcionan con HFC (los sistemas HFC no pueden funcionar con CFC).

Aunque existe cierta preocupación por el hecho de que la estabilidad (y la larga vida útil) de los perfluorocarbonos podría aumentar el calentamiento global, la Agencia de Protección Ambiental de EE. UU. ha aprobado varios perfluorocarbonos como sustitutos aceptables de los CFC para solventes de limpieza de productos electrónicos (consulte www.stanford.edu/dept /EHS/comply/alt.html ). Estoy enumerando estos en una tabla, junto con los puntos de fusión y ebullición enumerados para ellos en EL MANUAL DE QUÍMICA Y FÍSICA

Propiedades de perfluorocarbono

PERFLUOROCARBONO	Punto de fusión (ºC)	Punto de ebullición (ºC)
Perfluoropentano (C5F12)	-10	29.2
Perfluorohexano (C6F14)	-87,1	56,6
Perfluoroheptano (C7F16)	-78	82.5
Perfluorooctano (C8F18)	--	105.9

Es interesante notar que ciertos hidrocarburos fluorados tienen más del doble de la capacidad de transporte de oxígeno que la hemoglobina. Por ejemplo, Fluosal DA, una emulsión al 20% de perfluorodecalina y perfluorotripropilamina en agua, se ha utilizado como sustituto de la sangre en mamíferos. Una emulsión acuosa de 1-bromoperfluorooctano (LiquiVent, perflubron) comenzó los ensayos clínicos en los EE. UU. en 1996. Es posible que estas sustancias se puedan usar para aumentar los efectos de los perfluorocarbonos puros para mantener la oxigenación, mientras se reduce la temperatura.

Tengo grandes esperanzas de que los investigadores de 21CM se expandan en la línea de aplicar la química y la física a los problemas de la criobiología. En particular, aún quedan muchas preguntas por responder acerca de las interacciones moleculares que dan como resultado la toxicidad del CPA, el daño por enfriamiento, la formación de hielo, la vitrificación, etc., preguntas que, en última instancia, deben responderse en términos fisicoquímicos.

Para investigaciones más recientes, consulte el Proyecto de criopreservación de cortes de hipocampo .

Para obtener más información sobre los agentes crioprotectores, consulte Vitrificación en criónica .

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