diciembre 16, 2022
por Ben Mejor
CONTENIDOS: ENLACES A SECCIONES
- ANTECEDENTES
- EXPERIMENTOS INICIALES
- RESUMEN DE LOS DESCUBRIMIENTOS DE LOS EXPERIMENTOS INICIALES
- RESULTADOS FINALES
I. ANTECEDENTES
El Proyecto de criopreservación de cortes de hipocampo (HSCP) fue un proyecto de investigación realizado por los criobiólogos Dr. Gregory Fahy y Dr. Yuri Pichugin en la Universidad de California en Los Ángeles (UCLA) con fondos proporcionados por el Instituto de Criobiología Neural (INC) y UCLA. El objetivo del proyecto era criopreservar cortes de hipocampo mediante vitrificación a −130ºC, con total viabilidad al recalentamiento.
El hipocampo es el área del cerebro que se cree que es más crítica para aprender nueva información a través de un proceso conocido como LTP (potenciación a largo plazo) . Se realizan más experimentos neurofisiológicos en cortes de hipocampo que en cualquier otro tejido cerebral. El hipocampo también es el tejido cerebral más fácilmente dañado por la falta de oxígeno ( isquemia ) y es una de las primeras áreas del cerebro afectadas por la enfermedad de Alzheimer . Además de la importancia médica y neurofisiológica del hipocampo, está el hecho de que los cortes de hipocampo no solo son fáciles de estudiar y manipular, sino que son tan ampliamente estudiados por otros que existe una literatura y un equipo considerables para ayudar en el estudio.
El HSCP utilizó cortes de hipocampo que el Dr. Pichugin preparó a partir de cerebros de rata y evaluó su viabilidad en una cámara de Oslo. Una cámara de Oslo es un recipiente de plástico que parece una cacerola con particiones aireadas donde se pueden mantener rebanadas de hipocampo en un ambiente controlado por temperatura, oxigenación y humedad. Los cortes de hipocampo de una rata adulta pueden vivir en las Cámaras de Oslo durante 12 horas o más. Las lesiones en rodajas que se producen durante la extracción quirúrgica del cerebro de una rata pueden incluso sanar en la Cámara de Oslo.
II. EXPERIMENTOS INICIALES
Un experimento inicial comparó la introducción de varios crioprotectores con aumentos escalonados (y lavados) de crioprotectores para alcanzar la concentración máxima a 22 ºC, 2 ºC y −22 ºC. Se añadió manitol en el lavado para amortiguar las sacudidas osmóticas. En este experimento inicial, se utilizó el colorante MTT (que mide la capacidad de las mitocondrias para transportar electrones) para indicar la viabilidad.
Los crioprotectores utilizados en este experimento inicial fueron etilenglicol (utilizado en anticongelantes para automóviles), DMSO (dimetilsulfóxido), glicerol y V EG (pronunciado "Vee Ee Gee", no "veg"). V EG es una modificación del cóctel crioprotector VS41A (VS41A es una solución de vitrificación que es una mezcla de DMSO, formamida y propilenglicol) en la que el propilenglicol se reemplaza con un peso igual de etilenglicol (el "EG" de V EG ). [ V EG es la patente 6,395,467 -- Medicina del siglo XXI ( 21CM) -- compuesta de 16,84 % p/v de etilenglicol, 13,96 % p/v de formamida y 24,2 % p/v de DMSO, totalizando 55 % p/v de solución crioprotectora]. DMSO mostró la peor viabilidad, etilenglicol la siguiente peor, y el glicerol fue el tercero peor en dos de las 3 temperaturas estudiadas, siendo V EG el mejor en general. La superioridad del glicerol sobre el DMSO fue tranquilizadora en vista de los resultados experimentales no publicados de Isamu Suda que mostraban la misma superioridad para los cerebros completos (ver el siguiente párrafo).
Décadas atrás, el experimentador japonés I. Suda expuso cerebros enteros de gatos a glicerol al 15 %, los almacenó durante 5 días a -20 ºC y luego demostró que los cerebros de gatos tenían patrones de EEG similares a los de los cerebros de gatos que no habían sido sometidos a enfriamiento [ NATURE 212:268-270 (1966) y BRAIN RESEARCH 70:527-531 (1974)]. Siguiendo el espíritu de Suda, los cortes de hipocampo se sometieron a glicerol al 30 % y luego se almacenaron durante 12 horas a −20 ºC, −40 ºC y −76 ºC o se enfriaron a estas temperaturas y se volvieron a calentar sin almacenamiento. En estos y todos los experimentos posteriores, el ensayo de viabilidad se basó en la relación potasio/sodio (K + /Na +relación). Para el tejido neural, especialmente, la capacidad de las células para mantener el potencial de membrana con la bomba de sodio es un indicador de viabilidad fácil de medir y confiable. Según este ensayo, aunque los controles expuestos al 30 % de glicerol mostraron una viabilidad del 70 %, los enfriados y almacenados a -20 ºC estaban esencialmente muertos. Los almacenados a -40 ºC y -76 ºC tenían una viabilidad ligeramente mejor, pero no más del 15 % de viabilidad, y los efectos del enfriamiento a -76 ºC no mejoraron con el calentamiento inmediato desde esa temperatura (sin almacenamiento). El uso de 30 % de V EG en lugar de glicerol produjo resultados aún peores, posiblemente porque la temperatura de introducción de V EG era demasiado alta. V EG debe agregarse a una temperatura más baja que el glicerol .
Además del daño de los cristales de hielo por congelación y la toxicidad del crioprotector, los intentos de crioconservar órganos y tejidos también se ven obstaculizados por un fenómeno conocido como lesión por frío . Para investigar este fenómeno, se enfriaron cortes de hipocampo a 0ºC durante una hora (sin crioprotector) y luego se volvieron a calentar y analizar. Los cortes mostraron un 30% de viabilidad de los controles que se habían mantenido a 37ºC. Los cortes de hipocampo mantenidos a 0ºC en Líquido Cefalorraquídeo artificial ( aCSF ) durante 50 minutos también mostraron un 30% de viabilidad. Este resultado no cambió al usar aCSF modificado que contenía manitol ( maCSF ) en lugar del aCSF estándar, a los 50 min de exposición a 0ºC. Pero agregar un 10 % de glicerol pareció reducir un poco el daño por frío, y agregar un 10 % de VEG dio como resultado una viabilidad del 40%. V EG al 25 % (con y sin manitol) dio como resultado una viabilidad del 50 %. Estos resultados indican un efecto protector de V EG contra el daño por frío a 0ºC.
El experimento se repitió con controles a 37ºC y 10ºC, así como con rodajas de 25% V EG a 10ºC y 0ºC. Hubo poca diferencia significativa entre los controles de 37ºC, los controles de 10ºC o los cortes de EG de 10ºC y 25% V , pero los cortes de EG de 0ºC y 25% perdieron un 30% de viabilidad. Esto indica que el daño por frío ocurre entre 10ºC y 0ºC. Se obtuvieron peores resultados con la adición de V EG a 15 ºC, lo que indica que 10 ºC es la temperatura óptima para la introducción de V EG . Además, a 10ºC, la introducción de V EG en pasos de 5 minutos de concentración creciente produjo una mejor viabilidad que la introducción de V EG.en pasos de 10 minutos, lo que indica que el daño por toxicidad es más importante que el daño osmótico a esta temperatura y para estos tiempos y concentraciones. Los experimentos también indicaron que el manitol 300 mM es la concentración óptima para amortiguar el daño osmótico durante la eliminación de V EG .
Las soluciones portadoras pueden mejorar la crioprotección. La RPS−2 (Renal Preservation Solution number 2) fue desarrollada por el Dr. Fahy en 1981 como resultado de estudios en cortes de riñón. RPS-2 en realidad dio como resultado una viabilidad de los cortes de hipocampo a 10 ºC, que fue un 50 % mayor que la de los cortes de control a 37 ºC después de una hora en la cámara de Oslo (aunque la diferencia desapareció después de 2 horas). Una combinación de V EG al 25 % con RPS−2 a 10 ºC dio como resultado una viabilidad completamente igual a la de los controles a 37 ºC, aunque 25 % de V EG es una concentración insuficiente para la vitrificación. Al llevar la concentración de V EG al 50 % en RPS−2 a 10 ºC, la viabilidad de los cortes volvió a bajar al 50 % en comparación con los controles a 37 ºC.
El siguiente experimento se basó en la idea de que tanto el daño por frío como la toxicidad deberían reducirse a temperaturas bajo cero. Se añadió V EG a 10 ºC en pasos hasta una concentración del 25 %, y se añadió (y se lavó) un 25 % final de V EG (llevando el total al 50 %) a -10 ºC. Estos cortes de 50% V EG fueron solo ligeramente menos viables (y no estadísticamente menos viables) que los controles a 37ºC. La concentración de V EG necesaria para vitrificar se estima en un 53 %. Agregar (y luego lavar) 30 % en lugar de 25 % de V EG a -10 °C (llevando el total a 55 %) dio como resultado una viabilidad del 77 % de la de los controles.
En el siguiente experimento, un grupo de rebanadas con 53 % de V EG se mantuvo a -10 ºC mientras que el otro grupo con 53 % de V EG se enfrió a la temperatura de vitrificación (-130 ºC) y luego se volvió a calentar. Los cortes de V EG al 53 % no vitrificados tenían una viabilidad del 60 % y los cortes de V EG al 53 % vitrificados tenían una viabilidad del 56 % en comparación con los controles no tratados. La diferencia entre los cortes tratados con V EG y los cortes expuestos a V EG y luego vitrificados no fue estadísticamente significativa. Pero cuando se repitió el experimento, el grupo vitrificado fue significativamente menos viable.
El siguiente experimento agregó V EG a intervalos de 5 minutos a 10 ºC, pero la adición final (y el lavado) a -10 ºC se dio 10 minutos para la difusión. La viabilidad de los cortes no vitrificados expuestos al 53 % de V EG fue del 65 %, pero cuando los cortes tratados de esta manera se vitrificaron, la relación K/Na fue solo del 42 % del control K/Na, quizás debido a un equilibrio inadecuado. En conclusión, el uso de pasos de 10 minutos en todas las fases del procedimiento de adición y lavado pudo proteger completamente contra la lesión por vitrificación/desvitrificación, pero se asoció con una mayor toxicidad. No obstante, la viabilidad después de la vitrificación fue de hasta el 56 % de la viabilidad del control sin tratar.
Los experimentos posteriores utilizaron bloqueadores de hielo y cócteles crioprotectores menos tóxicos que V EG , así como tiempos de equilibrio más prolongados antes de la vitrificación. El peor de estos experimentos más nuevos dio resultados iguales a los mejores resultados obtenidos con V EG , y los mejores resultados de los experimentos más nuevos no indicaron diferencias entre los cortes vitrificados y los controles no tratados. Sin embargo, la variabilidad de los resultados fue muy alta, hasta más o menos el 25 %, con una viabilidad media del 75 % de los cortes de hipocampo que se vitrificaron a -130 ºC. Se dedicaron esfuerzos a reducir esta variabilidad y acercar la viabilidad promedio al 100%.
tercero RESUMEN DE LOS DESCUBRIMIENTOS DE LOS EXPERIMENTOS INICIALES
Actualmente, la vitrificación da como resultado una recuperación de la relación K/Na al menos cinco veces mayor que la que se podría obtener después de la congelación, a pesar de que la congelación implicaba concentraciones de glicerol más altas que las utilizadas por Suda.IV. RESULTADOS FINALES
Los resultados finales del HSCP se publicaron en la edición de abril de 2006 de la revista revisada por pares CRYOBIOLOGY -- [CRYOBIOLOGY 52(2):228-40 (2006)] . (También disponible como archivo PDF: Criopreservación de cortes de hipocampo de rata por vitrificación )
Cuando los cortes de hipocampo se trataron con V EG al 50 % p/v en una solución transportadora de LCRa a 0 ºC, hubo un daño considerable, que se eliminó en su mayoría mediante el uso de la solución transportadora RPS-2 en lugar de LCRac. Pero 53% p/v de V EG fue la concentración mínima que vitrificaría a las velocidades de enfriamiento utilizadas en el estudio. Un aumento de la concentración de V EG del 50 % p/v al 53 % p/v provocó una reducción considerable de la viabilidad por encima de -10 ºC (pero ningún daño adicional de -10 ºC a -130 ºC).
Los problemas de viabilidad se eliminaron utilizando VM3 en lugar de V EG como solución crioprotectora. VM3 no es tóxico (>90 % de recuperación de la relación K/Na tras la exposición de los tejidos a VM3). Los cortes tratados con VM3 enfriados a -130ºC (vitrificados) y recalentados fueron tan viables como los cortes tratados con VM3 sin enfriamiento. VM3 se compone de 16,84 % p/v de etilenglicol, 12,86 % p/v de formamida, 22,3 % p/v de DMSO, 7 % p/v de polivinilpirrolidina K12, 1 % p/v de bloqueador de hielo "Supercool X-100" y 1 % w/v "Supercool Z-100" bloqueador de hielo en una solución portadora de LM5 en lugar de RPS-2. LM5 maximiza la eficacia de los bloqueadores de hielo mejor que RPS-2.
Las micrografías electrónicas (EM) de las regiones CA1 y CA3 del hipocampo en VM3 después de enfriar a -130 ºC y recalentar mostraron una conservación completa de la ultraestructura, de acuerdo con los ensayos de viabilidad >90 % obtenidos del mismo tratamiento con VM3. La temperatura de transición vítrea ( T g ) tanto de V EG como de VM3 es de 3-4 ºC por encima de -130 ºC, por lo que las muestras se habían vitrificado (solidificado).
Estos resultados demuestran la capacidad de enfriar cortes de hipocampo a -130ºC y recalentarlos sin pérdida de viabilidad.
Para obtener más información sobre los agentes crioprotectores, consulte Resumen de los primeros seminarios de 21CM .
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