viernes, 16 de diciembre de 2022

Movilidad molecular a baja temperatura

 

CONTENIDOS: ENLACES A SECCIONES

  1. NOTAS INTRODUCTORIAS
  2. ENLACES DE HIDRÓGENO
  3. ECUACIONES DE DIFUSIÓN
  4. VISCOSIDAD Y TRANSICIÓN VIDRIO

I. OBSERVACIONES INTRODUCTORIAS

Con el uso de crioprotectores adecuados (compuestos "anticongelantes") en pacientes con criónica , el daño por cristales de hielo puede eliminarse virtualmente. (Las estimaciones para neuropacientes criónicos vitrificados recientes están en el rango de 0,2% de agua que se convierte en hielo). Cuando los tejidos biológicos se vitrifican, en lugar de congelarse, se endurecen lentamente como el vidrio, y el endurecimiento solo se completa en el rango de −130ºC. A temperaturas tan bajas, la viscosidad es alta y el daño debido a la movilidad molecular es bajo. El daño por radiación también se minimiza, porque la mayoría de los efectos dañinos de la radiación ionizante se deben a la movilidad de los átomos o moléculas de radicales libres [ ULTRAMICROSCOPIA; Knopek,E; 10(1-2):71-86 (1982)]. Pero, ¿pueden cuantificarse la movilidad y los daños de tal manera que puedan estimarse los efectos a lo largo de décadas o siglos?

La movilidad molecular de las muestras biológicas se puede analizar indirectamente a temperatura de hielo seco (alrededor de −80 ºC) sobre la base de la pérdida de viabilidad con el tiempo. Las plaquetas humanas se pueden almacenar a temperatura de hielo seco hasta por dos años sin pérdida de calidad [VOX SANGUINIS; Melaragno,AJ; 49(4):245-258 (1985)]. Los glóbulos rojos almacenados a temperatura de hielo seco durante 18 años en glicerol han mostrado tasas de rotura del 6,7 % si se transportan y del 2,4 % si no se transportan [TRANSFUSIÓN; Valeri, CR; 45(5):822-823 (2005)]. El esperma de ratón almacenado a temperatura de hielo seco durante 4 meses en una solución de criopreservación de rafinosa mostró solo un poco menos de fertilidad (71 %) que el esperma de ratón almacenado a temperatura de nitrógeno líquido durante 8 meses (73 %), pero el esperma de ratón almacenado durante 8 meses en hielo seco temperatura mostró significativamente menos fertilidad (51%) [ANIMALES DE EXPERIMENTACION; Okamoto,M; 50(1):83-86 (2001) ]. Los estudios bioquímicos de cortes de hígado de rata de 3 a 4 milímetros de espesor mostraron solo una ligera disminución en la actividad enzimática después de dos semanas de almacenamiento a temperatura de hielo seco [HISTOQUÍMICA Y BIOLOGÍA CELULAR; Prento,P; 108(6):543-547 (1997)].

El criobiólogo Peter Mazur ha declarado que por debajo de los −130ºC "... la viscosidad es tan alta (>10 13 Poise) que la difusión es insignificante en períodos de tiempo inferiores a los geológicos". Añade que "... no hay ningún caso confirmado de muerte celular atribuido al almacenamiento a -196 ºC durante unos 2-15 años y ninguno incluso cuando las células están expuestas a niveles de radiación ionizante unas 100 veces superiores durante hasta 5 años". [REVISTA AMERICANA DE FISIOLOGÍA; Mazur,P; 247 (3 Pt 1): C125-C142 (1984)]. Embriones de ratón congelados de 8 células sometidos al equivalente de 2000 años de rayos gamma de fondo durante 5 a 8 meses en nitrógeno líquido no mostraron ningún efecto perjudicial sobre la supervivencia o el desarrollo [ JOURNAL OF REPRODUCTION AND FERTILITY; Glenister, PH; 70(1):229-234 (1984) ].

Estas afirmaciones son tranquilizadoras, pero sería interesante saber cuáles son las movilidades moleculares exactas en un sólido vitrificado o en un paciente de criónica humano semivitrificado. Lo que puede ser una difusión "insignificante" para los propósitos de Mazur puede tener un impacto significativo en los casos de criónica. La pérdida de información es posible en una célula que, sin embargo, sobrevive. Tener una idea de qué tan lejos, en relación con otras moléculas, una molécula de agua podría moverse a estas temperaturas podría dar una idea de cuánta "mezcla" y "disolución" es posible durante un período de 100 años.

Para un gas ideal, la temperatura se puede expresar como velocidad molecular, pero para un líquido o sólido, la unión entre moléculas o átomos afectará significativamente la movilidad molecular a bajas temperaturas. Parecería que la viscosidad estaría en proporción directa con la movilidad molecular, pero no existe una fórmula simple para expresar la velocidad de las moléculas en un sólido con una viscosidad de 10 13 Poise.

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II. ENLACES DE HIDRÓGENO

El enlace de hidrógeno en el hielo no es el mismo que se ve en el agua. [Ver ENLACE DE HIDRÓGENO por S. Vinogradov & R. Linnel (1971) Sección 1-1, y Felix Franks Capítulos 3 y 4]. Las entalpías de enlace H en el hielo I varían de 4,7 a 8,2 kcal/mol, mientras que las entalpías de enlace H en el agua varían de 1,3 a 2,8 kcal/mol. Un enlace H del agua tiene una vida media de aproximadamente 2x10 −13 segundos. A 0ºCelcius, las moléculas de agua experimentan 10 11 a 10 12 movimientos de reorientación y traslación por segundo, mientras que las moléculas de hielo a la misma temperatura experimentan 10 5 a 10 6 movimientos de reorientación y traslación por segundo. Sin embargo, los enlaces de hidrógeno tetraédricos en una red de cristales de hielo son casi tan fuertes como los enlaces covalentes, en contraste con la red aleatoria de enlaces de hidrógeno flexibles e intercambiables que se encuentran en el agua líquida. Una solución de etanol tiene incluso más enlaces de hidrógeno que el agua (98 %) pero sigue siendo fluida. Se esperaría que las moléculas en el sólido semi-vitrificado de un paciente criónico (hielo, glicerol/agua, sales, proteína, grasa) tuvieran más movilidad que las moléculas en un cristal de hielo, en particular las moléculas de agua que son motivo de preocupación debido a su posible papel en la disolución y la hidrólisis. Las moléculas en un paciente de criónica totalmente vitrificado (<0,2 % de hielo) (crioprotector sin glicerol) tendrían algo más de movilidad.

A 135 Kelvin (−138º Celcius) el agua vitrificada tiene una energía vibratoria de 17,91 KJoule/mol y una energía de flexión de 1,93 KJoule/mol a diferencia del hielo I que tiene 18,55 y 0 KJoule/mol, respectivamente. Parece razonable que la diferencia de movimiento de traslación entre un cristal y un sólido vítreo a la temperatura del nitrógeno líquido sea probablemente inferior a un orden de magnitud.

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tercero ECUACIONES DE DIFUSIÓN

Sería bueno tener herramientas analíticas con las que cuantificar los posibles daños, y el conocimiento de la movilidad molecular a 143 K, 77 K y 4,2 K sería un paso en la dirección correcta. Las leyes de difusión para líquidos parecen ser buenos modelos para sistemas vitrificados en la medida en que una sustancia vítrea a baja temperatura puede considerarse como un líquido altamente viscoso. Sin embargo, la Primera Ley de Fick para la difusión no sería apropiada:


  
                        dc
       J = − DA ----
                        dx

  
          J = velocidad de difusión (moles/tiempo)
          D = Coeficiente de difusión = Difusividad de masa
          A = Área a través de la cual se produce la difusión
   dc/dx = gradiente de concentración (diferencia de concentración dividida por la distancia)

La primera ley de Fick establece que la velocidad de difusión a lo largo de un gradiente de concentración es proporcional a la magnitud instantánea del gradiente de concentración (que cambia a medida que avanza la difusión). Para el movimiento de moléculas de una región de mayor concentración a una región de menor concentración, dc/dx será negativo, por lo que multiplicar por −DA da un valor positivo a J. La difusión en un paciente de criónica vitrificada presumiblemente no se debe a gradientes de concentración porque no debe haber gradientes de concentración. Además, la Primera Ley de Fick depende de conocer un coeficiente de difusión, que se aproxima a lo que estamos tratando de determinar. El coeficiente de difusión es mayor para temperaturas más altas y para moléculas más pequeñas.

La ecuación de Einstein-Stokes es una fórmula para el cálculo de la difusividad browniana , donde la difusividad varía directamente con la temperatura absoluta y varía inversamente con la viscosidad y el radio molecular:


  
                kT
       D = -----
              6πrµ

  
            D = Difusividad browniana
            k = Constante de Boltzmann
           T = Temperatura absoluta (Kelvins)
            r = Radio de la molécula
           π = 3.14159265358979323... (pi)
           µ = Viscosidad del medio

Radius es particularmente revelador porque la fórmula está destinada a ser aplicable a moléculas esféricas grandes. Por supuesto, en un paciente de criónica vitrificada hay una mezcla muy heterogénea de moléculas, muchas de las cuales son bastante grandes o forman barreras de membrana (barreras de agua y aceite o bloqueo de moléculas grandes).

En última instancia, tendría que determinarse empíricamente una estimación de alta precisión de la movilidad molecular en un paciente de criónica. Sin embargo, desde el punto de vista analítico, para una temperatura dada, el límite inferior de la movilidad molecular podría ser el de un cristal de hielo (quizás no sea útil, ya que esta movilidad sería cercana a cero) y el límite superior podría ser el dictado por la ecuación de Einstein-Stokes utilizando la viscosidad y diámetro medio de una molécula crioprotectora.

Una vez que se estima o determina empíricamente una tasa de difusión, los únicos "pequeños problemas" que quedan son determinar cuánto tiempo se espera que un paciente de criónica se almacene antes de la reanimación y cuantificar cuán dañina sería la movilidad molecular determinada a esa temperatura.

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IV. VISCOSIDAD Y TRANSICIÓN VIDRIO

Con la vitrificación, un líquido se convierte en vidrio, con una ralentización espectacular del movimiento de difusión de las moléculas y una aparente pérdida de la capacidad de fluir. Pero la estructura molecular líquida se conserva. El movimiento de traslación y rotación de las moléculas cesa nominalmente a la temperatura de transición vítrea ( Tg ), dejando sólo el movimiento vibratorio para la energía térmica. Un "modelo de empuje", sin embargo, sostiene que algo de flujo ocurre dentro de los vidrios por medio de fluctuaciones térmicas poco frecuentes que logran una energía de activación suficiente para "empujar a un lado" las moléculas adyacentes y causar un evento de flujo local [ QUINTA REUNIÓN INTERNACIONAL DE DISCUSIÓN SOBRE RELAJACIÓN EN COMPLEJO SISTEMAS; Dyre,JC; julio de 2005)]. En un vidrio, así como en un líquido viscoso, una tensión local se alivia por difusión, un proceso descrito a nivel molecular como relajación estructural . La difusión puede ocurrir cuando hay suficiente energía local para superar la "fricción molecular". Las ecuaciones de "salto de difusión" suelen ser mejores que la ecuación de Einstein-Stokes para determinar la difusividad en líquidos viscosos cerca de g . El alivio de las tensiones locales mediante la elevación intencional de la temperatura (para acortar el tiempo de relajación estructural) se denomina recocido . El alivio natural de las tensiones locales debido a la difusión a lo largo del tiempo se denomina envejecimiento .

Para líquidos sobreenfriados o sistemas amorfos (vítreos), el tiempo de relajación describe la rapidez con la que el sistema vuelve a ser un líquido o vidrio sobreenfriado en equilibrio cuando se somete a una tensión local. Aunque un líquido o vidrio viscoso sobreenfriado puede describirse como "metaestable" (o fuera de equilibrio) por no ser cristalino, el líquido o vidrio también puede describirse como "relativamente fuera de equilibrio" cuando se somete a una estrés local. En este sentido, la relajación estructural y el tiempo de relajación se pueden aplicar a vidrios y líquidos sobreenfriados de la misma manera que se aplicarían a cualquier líquido viscoso por encima de su punto de fusión.

La movilidad molecular disminuye al aumentar la viscosidad. O dicho de otro modo, la movilidad molecular es el recíproco de la viscosidad. Para los agentes formadores de vidrio hay un aumento significativo en la viscosidad asociado con la temperatura de transición vítrea ( Tg ). Para los crioprotectores, como los que se utilizan en la criónica, los enlaces de hidrógeno son la principal limitación del movimiento molecular. Las sustancias crioprotectoras con una g más alta (generalmente aquellas con un peso molecular más alto) tienen enlaces de hidrógeno que son más largos y más débiles que los de las sustancias con una g más baja ; la movilidad de traslación y rotación molecular se reduce de manera demostrable a la g [INVESTIGACIÓN SOBRE CARBOHIDRATOS; Trabajadores, WF; 339(6):1077-1085 (2004)].

Las semillas de guisantes que pueden germinar después de 3 a 50 años a 20 ºC pueden sobrevivir de 250 a 2466 años a 0 ºC — efecto debido a las diferencias en la movilidad molecular en el citoplasma vitrificado [ ACTAS DE LA ACADEMIA NACIONAL DE CIENCIAS (EE.UU.); Bultink,J; 97(5):2385-2390 (2000) ]. Si la vitrificación pudiera reducir la movilidad molecular a la de un estado cristalino, la energía térmica residual estaría restringida únicamente al movimiento vibratorio, que es mucho menos capaz de dañar las estructuras moleculares (y de desvitrificar ) que el movimiento de rotación y traslación. Los vidrios no tienen por qué fluir y, de hecho, es una leyenda urbana que el vidrio fluyó en los cristales de las ventanas antiguas .

Formadores de vidrio fuertes y frágiles por encima de T g
Formadores de vidrio fuertes y frágiles por encima de T<sub>g</sub>

Los líquidos vitrificantes se han clasificado como "fuertes" o "frágiles". El término frágil es confuso porque no se refiere a la tendencia a romperse bajo tensión mecánica, sino a un aumento muy rápido de la viscosidad a medida que la temperatura se acerca a g desde arriba. Las sustancias que se denominan frágiles tienden a tener más tipos de enlaces iónicos (o enlaces de hidrógeno), mientras que las sustancias que son fuertes (y muestran una modesta disminución de la viscosidad por encima de Tg ) tienen más enlaces covalentes. La "fuerza de agarre" cambia más radicalmente para el enlace iónico cerca de Tg . Los enlaces covalentes son más fuertes.(menos frágiles), y los grupos de moléculas que se mantienen unidas por enlaces covalentes son menos susceptibles a los cambios de fase molecular justo por encima de la Tg . Los crioprotectores de tipo glicerol (que se unen principalmente por enlaces de hidrógeno) son más "frágiles" que la sílice vítrea (que tiene coherencia covalente), pero son menos "frágiles" que las sustancias iónicas.

Una mezcla de sales anhidras fundidas de KNO 3 y Ca(NO 3 ) 2 en proporción molar 3:2 ( KNC — K + Ca +2 NO  ) es un líquido extremadamente frágil (como se puede ver en el diagrama). En general, los líquidos muy frágiles (como KNC) tienden a tener un cambio de capacidad calorífica alto en Tg , pero los líquidos con enlaces de hidrógeno (como los crioprotectores) tienen un cambio de capacidad calorífica más alto en Tg pero solo son moderadamente frágiles (ver recuadro del diagrama).

En la escala de temperatura Kelvin, es una regla general que g se produce en aproximadamente dos tercios del valor de la temperatura de fusión ( m ). Las sustancias para las que g /T m es significativamente superior a 2/3 son frágiles  [THERMOCHIMICA ACTA; Hancock, BC; 380:95-107 (2001)].

El carácter lineal de los formadores de vidrio fuertes vistos en una gráfica logarítmica de la viscosidad ( η ) frente al recíproco de la temperatura ( 1/T ) demuestra el comportamiento de una ecuación de Arrhenius, con la viscosidad en lugar de la velocidad de reacción ( k ) como el término de la derecha:

          k = A exp [−E a /RT] (Ecuación de Arrhenius)

donde k es la velocidad de reacción, A es una constante, exp indica que el término entre corchetes es una potencia de e (2,71828), a es la energía de activación, R es la constante universal de los gases y T es la temperatura. Una ecuación en la que la viscosidad ( η ) toma el lugar de la velocidad de reacción es apropiada para formadores de vidrio fuertes (en lugar de frágiles), para los cuales la movilidad molecular disminuye exponencialmente con la temperatura.

Para los formadores de vidrio frágiles (como los crioprotectores utilizados en la criónica) existe una relación exponencial casi doble entre la viscosidad y la temperatura. Para los formadores de vidrio frágiles, la gráfica de la viscosidad frente al recíproco de la temperatura por encima de Tg se ajusta con mayor frecuencia a la ecuación empírica de Vogel-Fulcher-Tammann ( VFT ):

           η = A exp [DT o /(TT o )]

donde A es una constante, exp indica que el término entre corchetes es una potencia de e (2.71828), o es la temperatura a la cual la movilidad molecular es cero (la temperatura VFT, donde la viscosidad se vuelve infinita cuando T = T o ), y D es una constante correspondiente a la fragilidad. Los valores crecientes de D cambian la solución de frágil a fuerte, por lo que la fragilidad se ha definido como el inverso de D. En la práctica, sin embargo, las soluciones reales rara vez se ajustan a la ecuación VFT en un rango completo de valores [ REVISIONES QUÍMICAS; Ángell, CA; 102:2627-2650 (2002)]. Los líquidos más frágiles (como KNC) se ajustan mal a la curva VFT, mientras que los líquidos moderadamente frágiles (como el glicerol) se ajustan muy bien a la curva. La relación o /T g también se ha utilizado como parámetro de escala para la desviación del comportamiento de Arrhenius, para una relación entre 0 (fuerte) y 1 (frágil) [DIARIO DE SÓLIDOS NO CRISTALINOS; Hodge, IM; 202:164-172 (1996)].

El tiempo de relajación del esfuerzo cortante ( τ s ) a menudo se calcula a partir de la viscosidad ( η ) mediante la ecuación de Maxwell:

           η = GRAMO  τ s    o    τ s  = η/GRAMO 

donde  es el módulo de cizallamiento instantáneo ("frecuencia infinita") o no relajado medido en una escala de tiempo tan corta que un líquido no tiene tiempo suficiente para fluir en respuesta a un esfuerzo aplicado.  cambia con la temperatura más rápidamente para líquidos frágiles. El tiempo de relajación es el tiempo promedio que le toma a un fluido viscoso eliminar toda la tensión asociada con un estrés de fluido impuesto. Un líquido es "similar a un sólido" en escalas de tiempo mucho más cortas que τ . Una definición común (pero no oficial) de g es una viscosidad de 10 12 Pascal-segundos (equivalente a 10 13Poise) o un tiempo de relajación de 100 segundos (una definición que ha sido ampliamente desplazada por la determinación calorimétrica).

La ecuación VFT a veces se escribe directamente en términos de tiempo de relajación como:

           τ s  = τ o  exp [DT o /(TT o )]

con τ o asignado un valor de 10 −14 segundos, lo que puede dar un buen ajuste para líquidos de fragilidad intermedia. Debido a que τ o y o son constantes, la ecuación VFT a menudo se escribe utilizando las constantes A , B y C en lugar de τ o , DT o y o , respectivamente.

En el modelo de Arrhenius, las energías de activación ( a ) pueden aumentar por un factor de tres por debajo de g  [ ACTAS DE LA ACADEMIA NACIONAL DE CIENCIAS (EE.UU.); Bultink,J; 97(5):2385-2390 (2000) ]. Los cambios de energía de activación para la estabilidad de los liposomas en cristales de azúcar también se han informado en Tg  [ BIOPHYSICAL JOURNAL; Sol,WQ; 70(4):1769-1776 (1996) ].

La temperatura de Kauzmann ( K , "temperatura de transición vítrea ideal") es una temperatura hipotética a la que se supone que la entropía configuracional de un líquido sobreenfriado se reduce a la de un estado cristalino. El valor de K se determina a partir de un gráfico de entropía configuracional ( c ) frente a la temperatura de un vidrio que se está enfriando. [ La entropía configuracional también se llama entropía posicional , definida como el número de posiciones espaciales que las moléculas pueden ocupar en un sistema. La entropía configuracional se distingue de la entropía térmica  JOURNAL OF CHEMICAL EDUCATION, Lambert,JL; 84(8):1548-1550 (2007)]. Extendiendo los valores de la curva de enfriamiento de entropía hasta el punto donde se cruza con la entropía del cristal se obtiene K . Extender más la línea da lugar a la "Paradoja de Kauzmann", una "catástrofe de entropía" en la que el líquido sobreenfriado tendría una entropía más baja que el cristal [ JOURNAL OF THE INDIAN INSTITUTE OF SCIENCE; Rao,KJ; 81:3-13 (enero-febrero de 2001) ].

TemperaturaParadoja de Kauzmann
[ Temperatura Kauzmann ][Paradoja de Kauzmann]

 

En los sistemas reales, el sobreenfriamiento no continúa indefinidamente y el resultado imposible asociado con la "catástrofe" K se evita mediante la formación de vidrio. No obstante, la capacidad calorífica y otras variables a temperaturas por debajo de g se acercan a las de un cristal, lo que indica que los cambios en la estructura molecular asociados con g reducen el movimiento de traslación y rotación de las moléculas a "casi la inmovilidad" asociada con un cristal [JOURNAL OF PHARMACEUTICAL CIENCIAS; Zhou,D; 91(8):1863-1872 (2002)].

K es una temperatura termodinámica hipotética para la cual se propone que la movilidad de las moléculas sea equivalente a la de un cristal (cerca de cero, pero no necesariamente). o es una temperatura cinética hipotética que representa una viscosidad infinita (movilidad cero), determinada por el ajuste empírico de la ecuación VFT a temperaturas superiores a g .

f es una función del tiempo
Tf es una función del tiempo

El enfriamiento a velocidades tan rápidas que no se puede medir la Tg durante el proceso de enfriamiento ("hiperapagado") es una herramienta útil para los investigadores que estudian los mecanismos de relajación y recocido porque los vidrios formados en estas condiciones tienen tiempos de relajación tan altos [JOURNAL OF NON CRYSTALLINE SÓLIDOS; Wang,L; 353(41-43):3829-3837 (2007)]. La temperatura ficticia ( f ) es la temperatura a la que un líquido sobreenfriado en equilibrio tiene la misma entropía (o entalpía) configuracional que el vidrio. Por encima de g (es decir, en equilibrio líquido) f  =  T . Tf depende en gran medida de la velocidad de enfriamiento. En hiperapagadof se determina después de que se haya formado el sólido. En estas condiciones, la Tg se determina al recalentar el vidrio y generalmente se define como un tiempo de relajación de 100 segundos o una viscosidad de 10 12 Pascal -segundos [ JOURNAL OF CHEMICAL FYSICS; Yue,Y; 120(17):8053-8059 (2004) ]. f está limitada por g y K , es decir, TK  <  f  <  g [ REVISTA DE QUÍMICA FÍSICA; Shamblin,SL; 103:4113-4121 (1999)].

Por debajo de Tg , la relajación es tan lenta que el tiempo de relajación puede describirse como una función del tiempo, es decir, el tiempo de relajación cambia a medida que avanza la relajación. Tf es una función del tiempo que se aproximará a una temperatura T1 impuesta . f se puede usar para escribir una ecuación VFT modificada (una forma de la ecuación de Adams-Gibbs ) para la cual la dependencia temporal de τ s está completamente determinada por cambios en f :

           τ s  = τ o  exp [DT o /(T(1 - (T o / f ))]

[INVESTIGACIÓN FARMACÉUTICA; Mao,C; 23(8):1906-1917 (2006)].

Tiempos de relajación por debajo de g
Tiempos de relajación por debajo de Tg

Para los formadores de vidrio fuertes K puede ser tanto como el doble del valor de o , pero para las sustancias frágiles K está cerca del valor de o . Para el etilenglicol, K es un 5% mayor que el valor de o  [ CARTAS DE REVISIÓN FÍSICA; Tanaka,H; 90(5):055701; 1-4 (2003) ]. Para el glicerol , se encontró que K era −138ºC y o era −145ºC. Para el etilenglicol K fue −158ºC y o fue −164ºC [REVISTA DE INVESTIGACIÓN DEL INSTITUTO NACIONAL DE NORMAS Y TECNOLOGÍA; CA Angell; 102(2):171-185 (1997) ]. (Los valores son para soluciones puras en lugar de soluciones a concentraciones necesarias para vitrificar). Estos resultados no están lejos de la estimación de que para materiales amorfos frágiles, como los crioprotectores utilizados en criónica, la temperatura ( o ) a la cual la movilidad molecular promedio se estima que "se aproxima a cero" a unos 50ºC por debajo de Tg [ THERMOCHIMICA  ACTA; Hancock,BC; 380:95-107 (2001)]. La Tg de las soluciones de vitrificación utilizadas en criónica, en las concentraciones necesarias para vitrificar, está cerca de −124ºC. Cálculo de TKy la determinación empírica confirma que existe una movilidad molecular medible en los sólidos amorfos por debajo de K  [ BIOPHYSICAL JOURNAL; Walters,C; 86(2):1253-1258 (2004) ]. Se han determinado tiempos de relajación de 3 a 5 años a temperaturas cercanas a los 50ºC por debajo de g para sorbitol amorfo, sacarosa, trehalosa e indometacina [JOURNAL OF PHYSICAL CHEMISTRY; Shamblin,SL; 103:4113-4121 (1999)]. La pérdida dialéctica en aisladores de vidrio cientos de grados por debajo de g se ha atribuido a iones alcalinos móviles y protones [JOURNAL OF APPLIED Physics; Sección C; Ángell, CA; 88(6):3113-3156 (2000)].

Estas estimaciones significarían que se requeriría una temperatura de almacenamiento para pacientes criónicos en el rango de −165ºC a −175ºC para prevenir los efectos de la movilidad molecular, a saber, la desvitrificación y el daño molecular directo. Estas temperaturas están muy por debajo  de las temperaturas de almacenamiento a temperatura intermedia ( ITS ) propuestas para evitar el agrietamiento.

A temperaturas superiores en un 20 % a la T g (a menudo denominada c , temperatura crítica), la difusión traslacional y rotacional es inversamente proporcional a la viscosidad según las ecuaciones de Einstein-Stokes y Debye, respectivamente. Entre Tc y Tg , la ecuación de Debye para la difusión rotacional sigue siendo válida, pero la ecuación de Einstein-Stokes falla Cerca de Tgel movimiento de traslación molecular en líquidos formadores de vidrio muy frágiles puede ser hasta dos órdenes de magnitud más rápido de lo que prediría Einstein-Stokes en función de la viscosidad [REVISTA DE FÍSICA QUÍMICA; Cicerone, MT; 104(18):7210-7218 (1996)]. El glicerol es lo suficientemente fuerte como para que la relación de Einstein-Stokes siga siendo válida para las temperaturas más bajas estudiadas [REVISTA DE FÍSICA APLICADA; Sección A.1.9.1; Ángell, CA; 88(6):3113-3156 (2000)], y esto probablemente también se aplica al etilenglicol, que tiene una fragilidad/resistencia similar.

Divergencia de los modos de relajación justo por encima de g
Divergencia de modos de relajación justo por encima de Tg

También en la región moderadamente por encima de Tg , el único mecanismo de relajación diverge cada vez más en un mecanismo de relajación lento ( α ) y rápido ( β ) a medida que se acerca a Tg desde arriba. El proceso de relajación lento ( α ) (que caracteriza a los líquidos frágiles) está asociado con la rotación molecular y la relajación del flujo en fluidos viscosos, y muestra un comportamiento no Arrhenius (más que exponencial). Por el contrario, el rápido ( β) el proceso de relajación (característico de los líquidos fuertes) está asociado con la excitación vibratoria (relajación de red de espín) y muestra el comportamiento de Arrhenius [REVISTA DE SÓLIDOS NO CRISTALINOS; Sokolov,AP; 172/174:138-153 (1994) y THEMOCHEMICA ACTA; Moynihan, CT; 280/281:153-162 (1996)]. El lento ( α ) proceso de relajación se desvanece por debajo de Tg .

Por debajo de la T g (alrededor de −124 ºC para las soluciones de vitrificación utilizadas en criónica), los tiempos de relajación deberían seguir una forma de Arrhenius, aunque todavía hay alguna desviación para los sistemas frágiles [REVISTA DE FÍSICA APLICADA; Sección B2; Ángell, CA; 88(6):3113-3156 (2000)]. A medida que la temperatura cae cada vez más por debajo de Tg , el comportamiento no Arrhenius disminuye rápidamente [ BIOPHYSICAL JOURNAL; Walters,C; 86(2):1253-1258 (2004) ]. La mayor parte del comportamiento no Arrhenius por debajo de g se observa en sistemas moleculares heterogéneos donde las especies iónicas pequeñas retienen la movilidad molecular dentro de especies moleculares más grandes que se inmovilizan en g [REVISTA DE SÓLIDOS NO CRISTALINOS; Mizuno,F; 352 (42/49): 5147-5155 (2006)]. Los sistemas frágiles son más heterogéneos que los sistemas fuertes. El comportamiento no Arrhenius se debe a cambios estructurales, y cuando los cambios estructurales se detienen en Tg , el comportamiento no Arrhenius desaparece por debajo de Tg . Pero aunque la estructura sea fija, el flujo puede ocurrir en un sólido vitrificado. El flujo ocurre incluso en un cristal por movimiento de defectos. Por razones similares, un vidrio que está muy por debajo de g mostrará una viscosidad (movilidad molecular) que es una función de temperatura de Arrhenius, posiblemente hasta cero Kelvin.

Gráficos de Amer Inst Physics Conf Proc; Ángell, CA; 256(1):3-19 (1992)
Viscosidades a T gPendientes en T gPendientes por debajo de T g
[ Viscosidades en T<sub>g</sub> ][ Pendientes en T<sub>g</sub>][ Taludes por debajo de T<sub>g</sub> ]

En la medida en que el componente no Arrhenius de la relación temperatura/viscosidad desaparece rápidamente por debajo de Tg , parece razonable extrapolar una línea de Arrhenius (fuerte) por debajo de Tg para estimar la viscosidad de los sólidos vitrificados (vidrios) a temperaturas inferiores a Tg . Pero el primer gráfico que se muestra en esta sección (etiquetado como "Formadores de vidrio fuertes y frágiles por encima de T g ") muestra todos los líquidos formadores de vidrio que tienen una viscosidad de 10 12 Pascal-segundos a g . (En la década de 1980, cuando se hizo el primer gráfico, g se definía típicamente como la temperatura donde la viscosidad es igual a 1012 Pascal-segundos.) Como muestra el gráfico en el primer cuadro anterior, cuando g se determina colorimétricamente, la viscosidad a g puede oscilar entre aproximadamente 10 8 Pascal-segundos (para los líquidos más frágiles) y 10 12 Pascal-segundos (para líquidos más frágiles). los líquidos más fuertes). Como se muestra en el gráfico del segundo cuadro, las pendientes para líquidos frágiles cerca de g están en el rango de alrededor de 50 en una gráfica de g /T contra log 10 η . Como se muestra en el gráfico del tercer cuadro, la pendiente de la línea es discontinua y cae de aproximadamente 50 a aproximadamente 10 con la transición al estado sólido a continuación.g . La viscosidad en estado sólido es diferente de la viscosidad en estado líquido, y se le ha llamado "viscosidad de fluencia" para indicar flujo por movimiento de defectos (que también puede ocurrir en un cristal).

El único crioprotector que se muestra en el primer gráfico de esta sección es el glicerol, que tiene una fragilidad muy cercana a la del ZnCl 2 . El glicerol no se muestra en el gráfico del primer cuadro anterior, pero se muestra que el ZnCl 2 tiene una viscosidad a g de 10 12 Pascal-segundos, que puede tomarse como un representante de la viscosidad a g para los crioprotectores utilizados en criónica. Una línea que interseca log 10 η de g /T  = 1,0 en 12 con una pendiente de 10 tendrá una intersección y de 2. Entonces, la línea de Arrhenius para estimar valores de viscosidad logarítmica por encima de 1,1  g /T(es decir, más del 10% por debajo de g ) sería la ecuación lineal simple:

log 10 η = 10 (T g /T) + 2   donde η es la viscosidad en Pascal-segundos.

He usado esta fórmula para obtener estimaciones de los valores de η a varias temperaturas usando −123ºC (150 K) como el valor de g (la T g aproximada de las mezclas de vitrificación utilizadas en criónica). La temperatura de almacenamiento intermedio (ITS) es de especial interés en criónica debido a la creencia de que almacenar pacientes a esta temperatura produciría muchas menos grietas debido al estrés térmico, y esta temperatura sería adecuada para la crioconservación durante décadas, si no siglos.

Para Temperatura de Almacenamiento Intermedio −135ºC (alrededor de 138 K) g /T  = (150/138) = 1.087 y la fórmula da:

      log 10 η  = (10*1.087) + 2 = 12.9 o     η  = 10 12.9 Pascal-segundos

Para los valores aproximados de K o o temperatura −165ºC (unos 108 K) g /T  = (150/108) = 1,39 y la fórmula da:

      log 10 η  = (10*1,39) + 1 = 15,9 o     η  = 10 15,9 Pascal-segundo

Para la temperatura del líquido −196ºC (alrededor de 77 K) g /T  = (150/77) = 1,95 y la fórmula da:

      log 10 η  = (10*1,95) + 1 = 21,5 o     η  = 10 21,5 Pascal-segundo

Por lo tanto, a la temperatura de almacenamiento intermedia (−135 ºC), el etilenglicol es aproximadamente 10 15 (un cuatrillón) de veces más viscoso que a 25 ºC (0,0161 Pa·s) y a la temperatura del nitrógeno líquido es casi 10 24 (un septillón) veces más viscoso. . (El jarabe de maíz es unas 85 veces más viscoso que el etilenglicol a 25ºC, y el etilenglicol es unas 18 veces más viscoso que el agua a esa temperatura).

En realidad, hay dos ecuaciones en la teoría cinética que se denominan relaciones de Einstein , la mencionada ecuación de Einstein-Stokes ( relación de Stokes-Einstein ):

               k segundo re
       = ------
              6πrη

y la relación de Einstein-Smoluchowski :

       re = μ pags k segundo T

que utiliza la movilidad μ p como velocidad de deriva resultante de una fuerza aplicada μ p  = V d /F . Eliminando D y resolviendo para μ p da la ecuación más simple:

                  1
       μ p  = ------
              6πrη

La movilidad de deriva μ p estará en unidades de metros por segundo por Newton de fuerza aplicada. (Tenga en cuenta que Pa·s = kg/(m·s) y N = (kg·m)/s 2 ) Pero la única fuerza experimentada por un paciente de criónica sería la fuerza de la gravedad, opuesta por una fuerza igual y opuesta debajo el paciente, razón por la cual el paciente de criónica no se mueve. En el nivel molecular, las fuerzas serían aleatorias, lo que daría como resultado un movimiento browniano .

El uso de la ecuación de Einstein-Stokes para encontrar el coeficiente de difusión ( D ) para una temperatura ( T ) y una viscosidad ( η ) determinadas proporciona los medios para determinar el desplazamiento típico de una molécula de agua (radio = 1,4 x 10 −10 metros) después de un siglo del movimiento browniano en un paciente de criónica. El valor de B ( constante de Boltzmann ) es 1,38 x 10 23 Joules/Kelvin, donde J/K = (kg·m 2 )/(s 2 K). Por lo tanto, la ecuación de Einstein-Stokes produce:

                                                        (1,38 kg·m 2 /s 2 K)(138K)
   D a −135ºC (~138K) = --------------------------- ----------------------- = 9,09 x 10 −26  m 2 /s
                                           6(3,1416)(1,4 x 10 −10  m)(10 12,9  kg/ (milisegundo))

De manera similar, D a −165ºC (~108K) = 7,11 x 10 −26  m 2 /s   y   D a −196ºC (~77K) = 1,27 x 10 −34  m 2 /s

La distancia típica que una molécula de agua se desplazará desde su posición inicial después de un tiempo t se puede estimar calculando la varianza ( σ 2 ) de la función de Green de la ecuación de difusión en tres dimensiones ( relacionando el movimiento browniano con un paseo aleatorio ):

       σ 2  = 6 Dt

Usando un valor de t igual a un siglo (3.156 x 10 9 segundos basado en 365.2425 días por año) de almacenamiento para un paciente de criónica, y sacando la raíz cuadrada de la varianza da la distancia típica ( desviación estándar ) que tendrá una molécula de agua viajado desde su punto de origen por la constante de difusión ( D ) para una temperatura y viscosidad dadas.

Para temperatura de almacenamiento intermedia (−135 ºC, ~138 K), la distancia típica que se habrá desplazado una molécula de agua en el transcurso de un siglo es de unos 40 nanómetros, mientras que para −165 ºC (~108 K) el desplazamiento es de aproximadamente un nanómetro y en nitrógeno líquido temperatura (−196ºC, ~77K) la distancia es de aproximadamente un picómetro y medio. Todos estos valores parecerían aceptables en un paciente de criónica si la distancia lineal típica recorrida por la molécula de agua fuera la misma que la distancia total. Pero la distancia lineal total real (longitud de la trayectoria) recorrida por la molécula de agua debido al movimiento browniano será mucho mayor que el desplazamiento típico desde el punto de origen. Haciendo el mismo cálculo para una molécula de agua a temperatura ambiente (25ºC, unos 298K) utilizando la viscosidad del etilenglicol (0. 0161 Pa·s) da una distancia típica de unos 1,4 metros. Una molécula de agua a temperatura ambiente recorrería un trayecto mucho mayor que 1,4 metros en el transcurso de un siglo.

También es preocupante la posibilidad de que dentro del vidrio haya iones que sean mucho más móviles que las moléculas que constituyen el vidrio. Una especie iónica (probablemente protones) en el vidrio de fosfato de dihidrógeno de trimetilamonio es nueve órdenes de magnitud más móvil que las moléculas de vidrio, y los iones de sodio en el vidrio de disilicato de sodio son doce órdenes de magnitud más móviles que las moléculas de vidrio [DIARIO DE SÓLIDOS NO CRISTALINOS; Mizurno,F; 352 (42/49): 5147-5155 (2006)]. Las moléculas de agua pueden ser bastante móviles cuando están en vidrio de polidextrosa, y el dióxido de carbono es móvil en alcohol polivinílico (misma referencia).

Sin embargo, la movilidad molecular no es letal para las ranas de madera del norte que pueden pasar semanas o meses en un estado semicongelado [ THE FASEB JOURNAL; Costanzo,JP; 9(5):351-358 (1995) ]. Los efectos más dañinos de la movilidad molecular a temperaturas por debajo de g deben ser las moléculas de agua que forman cristales o los radicales libres móviles. Con respecto a este último, el criobiólogo Peter Mazur fue citado al comienzo de este artículo diciendo: "... no hay ningún caso confirmado de muerte celular atribuido al almacenamiento a −196ºC durante unos 2-15 años y ninguno incluso cuando las células están expuestas a niveles de radiación ionizante unas 100 veces superiores durante hasta 5 años". [REVISTA AMERICANA DE FISIOLOGÍA; Mazur,P; 247 (3 Pt 1): C125-C142 (1984)].

Más experimentos que expongan los tejidos a la radiación ionizante podrían ser útiles para evaluar la seguridad para los pacientes de criónica de varias temperaturas inferiores a g por encima de la temperatura del nitrógeno líquido. También se deben realizar experimentos para determinar la posibilidad de formación de hielo a temperaturas criogénicas durante períodos prolongados. Se necesita más información antes de poder afirmar con certeza que el daño debido a la movilidad molecular a la temperatura de almacenamiento intermedia no sería peor que los efectos del daño por agrietamiento.

NOTA : Se estimaron aumentos más pronunciados de la viscosidad con la disminución de la temperatura para 7,05 M DMSO ( g  = −132 ºC) con viscosidad η  = 10 18  Pascal-segundos) para −140 ºC CRIOBIOLOGÍA; Rabin,Y; Figura 11; 53(1):75-95 (2006) , pero REVISTA DE FÍSICA APLICADA; Sección A.1.2.1; Ángell, CA; 88(6):3113-3156 (2000) y otras citas anteriores dejan claro que esta cifra es exagerada porque se basa en una aplicación inapropiada de la ecuación VFT por debajo de Tg ] .

La criopreservación como medio de Animación Suspendida

 

por Ben Mejor

CONTENIDOS: ENLACES A SECCIONES

  1. CRIPTOBIOSIS
  2. HIBERNACIÓN
  3. METABOLISMO DEPRIMIDO INDUCIDO
  4. METABOLISMO DISMINUIDO CON ENFRIAMIENTO
  5. PEQUEÑOS ANIMALES QUE SOBREVIVEN A LA TEMPERATURA CRIOGÉNICA
  6. VITRIFICACIÓN DE MAMÍFEROS
  7. DAÑO POR RADIACIÓN A TEMPERATURA CRIOGÉNICA
  8. ¿ANIMACIÓN SUSPENDIDA PARA VUELO ESPACIAL HUMANO?

I. CRIPTOBIOSIS

La criptobiosis es un estado de metabolismo detenido por un organismo que protege contra ambientes hostiles, como sequía, hambruna, falta de oxígeno o temperatura extrema [ BIOQUÍMICA Y FISIOLOGÍA COMPARATIVA; PARTE B; Clegg,JS; 128(4):613-624 (2001) ]. Mecanismos fisiológicos similares asociados con la protección criptobiótica contra la deshidratación y el frío se encuentran tanto en plantas como en animales [ JOURNAL OF EXPERIMENTAL BIOLOGY; Piso, KB; 210 (Pt 10): 1700-1714 (2004) ]. Las proteínas abundantes en embriogénesis tardía (LEA) protegen tanto a las plantas como a las proteínas animales de la sequía, el frío y el estrés osmótico [ BIOCHEMICAL JOURNAL; Goyal,K; 388 (parte 1): 151-157 (2005)]. Las proteínas de choque frío, las proteínas anticongelantes, los agentes nucleadores de hielo y los crioprotectores, junto con las proteínas LEA, son los principales mecanismos bioquímicos que permiten que las plantas y los animales resistan temperaturas bajo cero [ NATURWISSENSCHAFTEN; Margesin,R; 94(2):77-00 (2007) ].

Las bacterias Pseudomonas y Escherichia coli pueden sobrevivir congeladas a la temperatura del nitrógeno líquido sin sufrir mutaciones [ CRIOBIOLOGY; Ashwood-Smith,MJ; 2(1):39-43 (1965) ], pero los organismos multicelulares no son tan resistentes. Los artrópodos polares sobreviven a temperaturas bajo cero mediante la deshidratación y la producción de azúcares de bajo peso molecular y alcoholes de azúcar que actúan como crioprotectores [ JOURNAL OF INSECT FISIOLOGY; Worland,MR; 49(3):193-203 (2003) ]. Algunas especies pueden tolerar la congelación extracelular. El único animal conocido que sobrevive a la congelación intracelular es el nematodo antártico Panagrolaimus davidi . Panagrolaimus davidisometidas experimentalmente a congelación rápida, se formó un 54 % de hielo intracelular, pero sobrevivió un 53 % [ CRIOBIOLOGÍA; Warton, DA; 50(1):21-28 (2005) ].

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II. HIBERNACIÓN

Las marmotas en hibernación mantienen una temperatura corporal de 5ºC en temperaturas ambientales tan bajas como −1ºC [ FISIOLOGÍA RESPIRATORIA Y NEUROBIOLOGÍA; Heldmaier,G; 141(3):317-329 (2004) ]. Se ha demostrado que las ardillas terrestres del Ártico hibernan durante al menos dos meses a temperaturas de hasta -2,9 ºC sin congelarse [ CIENCIA; Barnes,BM; 244:1593-1595 (1989) ].

Los animales de sangre caliente que no hibernan sufren efectos adversos cuando se les somete a temperaturas por debajo de los 28 ºC, incluidos escalofríos extremos, alta viscosidad de la sangre y paro cardíaco [ JOURNAL OF THE AMERICAN VETERINARY ASSOCIATION; Luna, PF; 202(3):437-444 (1993) ]. Se han realizado esfuerzos farmacológicos para reducir el umbral de escalofríos y la termorregulación natural contundente en humanos para aumentar los beneficios de la hipotermia terapéutica [ STROKE; Sessler, DI; 40(11):e614-e621 (2009) ]. Aunque los osos son capaces de tener un metabolismo deprimido, la temperatura de su cuerpo permanece por encima de los 30 ºC, y algunos escalofríos ayudan a mantener la fuerza muscular y la temperatura [ AMERICAN JOURNAL OF FISIOLOGÍA; McGee-Lawrence, ME; 295(6):R1999-R2014 (2008) ].

Se han realizado varios estudios de proteínas y expresión génica en mamíferos en hibernación [ MOLECULAR & CELLULAR PROTEOMICS; Shao,C; 9(2):313-326 (2010) y TENDENCIAS EN ENDOCRINOLOGÍA Y METABOLISMO; Melvin, RG; 20(10):490-498 (2009) ]. Es probable que los genes de los mamíferos en hibernación se conserven en el genoma humano, de modo que la inducción de estos genes podría ser un medio para colocar a los humanos en un estado de "animación suspendida" [ BIOENSAYS; Andrews, MT; 29(5):431-440 (2007) ].

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tercero METABOLISMO DEPRIMIDO INDUCIDO

En condiciones anóxicas, los embriones de pez cebra ( Danio rerio ) entran en un estado de animación suspendida reversible caracterizado por un latido cardíaco detenido y una progresión del ciclo celular detenida [ ACTAS DE LA ACADEMIA NACIONAL DE CIENCIAS (EE.UU.); Padillo, PA; 98(13):7331-7335 (2001) ]. Los nematodos Caenorhabditis elegans (que responden a la anoxia entrando en animación suspendida y sobreviven a la hipoxia deprimiendo el metabolismo con el factor 1 inducible por hipoxia ), pueden ser inducidos a un estado de animación suspendida con monóxido de carbono [ PROCEEDINGS OF THE NATIONAL ACADEMIA OF SCIENCIAS (EE. UU.); nistul, TG; 101(24):9133-9136 (2004)]. El factor inducible por hipoxia no solo deprime el metabolismo, sino que también deprime los mecanismos apoptóticos [ ANTIOXIDANTS & REDOX SIGNALLING; Snyder, CM; 11(11):2673-2683 (2009) ]. C. elegans con exposición de por vida al sulfuro de hidrógeno tiene una vida media aumentada en un 70 %, pero sin ninguna reducción aparente en la tasa metabólica [ ACTAS DE LA ACADEMIA NACIONAL DE CIENCIAS (EE. UU.); Miller,DL; 104(51):20618-20622 (2007) ].

La ardilla terrestre de manto dorado Spermophilus lateralis es un mamífero en hibernación que puede ser inducido por hipoxia a un estado de metabolismo deprimido y temperatura corporal reducida [ JOURNAL OF APPLIED FISIOLOGY; Barros,RCH; 91(2):603-612 (2001) ]. También se ha demostrado que la hipoxia reduce el metabolismo en pequeños mamíferos que no hibernan [ AMERICAN JOURNAL OF PHYSIOLOGY; Frapell,P; 262(6 Pt 2):R1040-R1046 (1992) ], pero la hipoxia no parece tener este efecto en los grandes mamíferos [ JOURNAL OF APPLIED FISIOLOGY; Korducki,MJ; 76(6):2380-2385 (1994) ].

El ratón, un mamífero que no hiberna, puede ser inducido con sulfuro de hidrógeno a entrar en un estado de "animación suspendida" que reduce la tasa metabólica en un 90% y deja la temperatura corporal central solo 2ºC por encima de una temperatura ambiente de 13ºC [ CIENCIA; Blackstone,E; 308:518 (2005) ]. Se cree que este efecto se debe a la inhibición del sulfuro de hidrógeno de la citocromo c oxidasa en las mitocondrias, inhibiendo así la fosforilación oxidativa. Se ha producido un efecto similar en ratas usando concentraciones más altas de sulfuro de hidrógeno [ THE JOURNAL OF TRAUMA; Morrison, ML; 65(1):183-188 (2008) ], aunque otro estudio fracasó en deprimir el metabolismo en ratas usando sulfuro de hidrógeno [ RESPIRATORY FISIOLOGÍA & NEUROBIOLOGÍA; Haouzi,P; 167(3):316-322 (2009)]. Algunos investigadores no lograron deprimir el metabolismo con sulfuro de hidrógeno en ovejas [ FISIOLOGÍA RESPIRATORIA Y NEUROBIOLOGÍA; Haouzi,P; 160(1):109-115 (2008) ] o lechones [ MEDICINA DE CUIDADOS CRÍTICOS PEDIÁTRICOS; Zhang,LJ; 9(1):110-112 (2008) ], mientras que otros investigadores lograron reducir el metabolismo y la temperatura en cerdos [ SHOCK; Simón,F; 30(4):359-364 (2008) ].

Recientemente se ha sugerido la inducción de un metabolismo deprimido (hibernación) en mamíferos (incluidos los humanos) con la proteína quinasa activada por AMP [ REVISIÓN ANUAL DE MEDICINA; Lee, CC; 59:177-186 (2008) ].

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IV. METABOLISMO DISMINUIDO CON ENFRIAMIENTO

Cuando los animales bajan la temperatura corporal su tasa metabólica se reduce casi a la mitad por cada 10ºC de descenso entre 40ºC (temperatura corporal aproximada) y 0ºC [ JOURNAL OF BIOENERGETICS; Razón, JK; 4(1):285-309 (1973) y NATURE; Davidson,EA; 440:165-173 (2006) ]. Las personas, especialmente los niños, que se han caído en agua fría han sido protegidas por hipotermia de un posible daño cerebral después de que su corazón haya estado detenido durante una hora [ JOURNAL OF THE AMERICAN MEDICAL ASSOCIATION; Bolte,RG; 260(3):377-379 (1988) ]. Una niña de 31 meses sin pulso que había pasado casi seis horas a temperaturas exteriores por debajo de -20ºC y tenía una temperatura rectal de 14ºC sobrevivió con una recuperación neurológica completa [ THE JOURNAL OF TRAUMA; Dobson,JA; 40(3):483-485 (1996)].

Los perros enfriados a 34ºC después de diez minutos de fibrilación ventricular inducida pudieron sobrevivir 60 minutos de fibrilación ventricular con buen resultado neurológico [ CIRCULACIÓN; Nozari,A; 113(23):2690-2696 (2006) ]. Se ha demostrado que la hipotermia modula las concentraciones cerebrales de proteínas pro y antiapoptóticas a favor de la prevención de la muerte celular neuronal [ ACTA ANAESTHESIOLOGICA SCANDINAVIA; Eberspacher,E; 49(4):477-487 (2005) ]. Una revisión de modelos animales de accidente cerebrovascular isquémico encontró que el volumen del infarto se redujo en aproximadamente un tercio al enfriar a 35 °C dentro de los 90 a 180 minutos posteriores al inicio del tratamiento permanente [ BRAIN; van der Worp,HB; 130 (parte 2): 3063-3074 (2007)]. En un estudio con cerdos, la mayoría de los cerdos enfriados a 10ºC sobrevivieron hasta 60 minutos de shock sin efectos neurológicos [ CIRUGÍA; Alam, HB; 132(2):278-288 (2002) ]. Seis de seis perros hipotérmicos experimentales que tenían una temperatura timpánica de 10ºC soportaron 90 minutos de paro cardíaco sin daño neurológico subsiguiente, y dos de siete aguantaron 120 minutos sin daño neurológico evidente [ MEDICINA DE CUIDADOS CRÍTICOS; Behringer,W; 31(5):1523-1531 (2003) ]. Los perros que recibieron perfusión sanguinolenta continua pudieron recuperarse de al menos cuatro horas por debajo de los 9 ºC y dos horas por debajo de los 5 ºC con una recuperación neurológica satisfactoria [ SITIO WEB DE ALCOR; hipotermia ultraprofunda sanguinolenta; hoja, JD; Darwin,MG; (1987) ].

Las víctimas humanas de fibrilación ventricular sometidas a solo 1ºC de hipotermia mostraron un aumento sustancial tanto en la supervivencia como en el resultado neurológico favorable [ MEDICINA DE CUIDADOS CRÍTICOS; Don,CW; 37(12):3062-3069 (2009) ]. Los seres humanos han sido sometidos a un paro cardíaco hipotérmico profundo para cirugía aórtica durante más de una hora sin déficits neurológicos graves. Los sujetos alcanzaron un silencio electrocerebral completo (índice biespectral electroencefalográfico cero) entre temperaturas de 16ºC y 24ºC [ REVISTA DE ANESTESIA CARDIOTORÁCICA Y VASCULAR; Hayashida,M; 21(1):61-67 (2007) ] y se recalentaron sin déficit neurológico, lo que confirma que la actividad cerebral dinámica se puede perder y recuperar sin pérdida de identidad personal.

Muchos reptiles e invertebrados pueden soportar temperaturas más bajas que los mamíferos y, por lo tanto, alcanzan un estado más profundo de metabolismo deprimido y animación suspendida. La rana de madera del norte ( Rana sylvatica ) puede sobrevivir en un estado semicongelado hasta -6ºC durante meses con una recuperación completa al recalentarse [ THE FASEB JOURNAL; Costanzo, JP; 9(5):351-358 (1995) ].

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V. PEQUEÑOS ANIMALES QUE SOBREVIVEN A LA TEMPERATURA CRIOGÉNICA

Se ha demostrado que las larvas del escarabajo de Alaska Cucujus clavipes puniceus sobreviven a temperaturas de hasta -100ºC [ THE JOURNAL OF EXPERIMENTAL BIOLOGY; Sformo,T; 213 (Pt 3):502-509 (2010) ]. La capacidad de alcanzar un estado anhidrobiótico (desecado) permite que algunos organismos toleren naturalmente las temperaturas criogénicas. Las larvas del quironómido africano Polypedilum vanderplanki , el animal multicelular más grande capaz de anhidrobiosis (el único insecto capaz de anhidrobiosis) supuestamente sobreviven a temperaturas tan bajas como -270ºC [ JOURNAL OF EXPERIMENTAL BIOLOGY; Watanabe,M; 206 (Pt 13): 2281-2286 (2003)]. La vitrificación por trehalosa y proteína ha demostrado ser esencial para la anhidrobiosis de los quironómidos [ ACTAS DE LA ACADEMIA NACIONAL DE CIENCIAS (EE.UU.); Sakarai,M; 105(13):5093-5098 (2008) ]. Los tardígrados , que son animales microscópicos similares a los artrópodos capaces de sufrir anhidrobiosis, pueden sobrevivir al enfriamiento a la temperatura del nitrógeno líquido (−196 ºC) incluso en un estado hidratado [ CRIOBIOLOGÍA; Ramlov,H; 29(1):125-130 (1992) ].

Los animales multicelulares tratados con crioprotectores han sobrevivido al enfriamiento a temperaturas criogénicas. Una variedad de helmintos parásitos han sobrevivido al almacenamiento en nitrógeno líquido después del tratamiento con DMSO, glicerol o etilenglicol [ CRIOBIOLOGY; James,ER; 49(3):201-210 (2004) ].

Muchas variedades de larvas de nematodos han sobrevivido a temperaturas criogénicas. El nematodo C. elegans se almacena rutinariamente en nitrógeno líquido . Los nematodos de plantas tratados con etilenglicol al 25 %, enfriados rápidamente y mantenidos en nitrógeno líquido durante unos minutos antes de almacenarlos en un congelador a -140 ºC durante un mes, mostraron una supervivencia del 85 % [ CRIOBIOLOGÍA; Irdani,T; 52(3):319-322 (2006) ]. Se lograron tasas de supervivencia de hasta el 70 % para larvas de nematodos parásitos tratadas con 10 % de DMSO antes de 16 meses de almacenamiento en nitrógeno líquido [ REVISTA INTERNACIONAL DE PARASITOLOGÍA; branquia,JH; 25(12):1421-1426 (1995)]. La mayoría de una variedad de larvas de especies de nematodos infecciosos tratadas con hipoclorito de sodio y solución salina sobrevivieron más de 15 años en nitrógeno líquido, aunque el porcentaje de infectividad fue menos de la mitad del porcentaje de supervivencia [ PARASITOLOGÍA VETERINARIA; van Wyk, JA; 88(3-4):239-247 (2000) ]. El nematodo parásito tropical sensible al estrés Radopholus similis tratado con una mezcla de metanol, glicerol y glucosa no mostró reducción de la infectividad o reproducción después del almacenamiento en nitrógeno líquido [ CRIOBIOLOGY; Elsen,A; 55(2):148-157 (2007) ].

La supervivencia completa (100%) de los juveniles infectados por nematodos entomopatógenos se logró después del tratamiento con glicerol y solución de Ringer antes de la conservación en nitrógeno líquido [ JOURNAL OF NEMATOLOGY; Bai,C; 36(3):281-284 (2004) ]. Se logró una supervivencia del 27 % para las larvas de anquilostomiasis humana ( Ancyclostoma ceylanicum ) tratadas con una solución de DMSO al 10 % y dextrano al 10 % antes de los 100 días en nitrógeno líquido [ AMERICAN JOURNAL OF TROPICAL MEDICAL HYGIENE; Duarte,J; 68(1):44-45 (2003) ]. Más del 50 % de las larvas de gusanos de trapo ( Nereis virens ) tratadas con 10 % de DMSO sobrevivieron al almacenamiento con nitrógeno líquido [ CRIOBIOLOGÍA; oliva,JW; 34(3):284-294 (1997)]. Del 60 al 70 % de los embriones de mosca de la fruta de 50 000 células ( Drospophila melanogaster ) vitrificados con etilenglicol y enfriados a -205 ºC eclosionaron tras el recalentamiento, y el 40 % de las larvas se convirtieron en adultos fértiles [ CIENCIA; Mazur,P; 258:1932-1935 (1992) ].

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VI. VITRIFICACIÓN DE MAMÍFEROS

El hielo ocupa un 9% más de volumen que el agua. Aunque es un error pensar que el agua revienta las células al congelarse en su interior , es cierto que la expansión del hielo en el espacio extracelular aplasta las células [ AMERICAN JOURNAL OF PHYSIOLOGY; Mazur,P; 247 (3 Pt 1): C125-C142 (1984) ]. La vitrificación lograda mediante la adición de suficiente crioprotector puede eliminar la formación de hielo durante el enfriamiento de tejidos biológicos a temperaturas criogénicas.

Se han vitrificado con éxito varios tejidos y órganos de mamíferos. Los vasos sanguíneos creados por ingeniería tisular vitrificados, almacenados a -135 ºC y recalentados mostraron una actividad metabólica comparable a los controles frescos [ TISSUE ENGINEERING; Dahl,SLM; 12(2):291-300 (2006) ]. Cortes de hipocampo de rata vitrificados, enfriados a -130ºC y recalentados mostraron 100% de viabilidad dentro del margen de error experimental [ CRIOBIOLOGY; Pichugin,Y; 52(2):228-240 (2006) ]. La tráquea de conejo que se vitrificó, se mantuvo en nitrógeno líquido y se recalentó fue comparable a las muestras frescas [ CRIOBIOLOGY; Xu,H; 58(2):225-231 (2009) ]. Se vitrificaron ovarios completos de ratón, se almacenaron en nitrógeno líquido y se recalentaron para producir tasas de natalidad de crías vivas comparables a las observadas con ovarios frescos.FERTILIDAD Y ESTERILIDAD; Hasegawa,A; 86 (Suplemento 3): 1182-1192 (2006) ].

El mayor logro de la vitrificación hasta la fecha ha sido la vitrificación de un riñón de conejo, enfriamiento a -135ºC, recalentamiento, retrasplante en el conejo y el riñón capaz de mantener al conejo indefinidamente como el único riñón funcional [ ORGANOGÉNESIS; Fahy, GM; 5(3):167-175 (2009) ]. Pero esto está muy lejos de vitrificar un conejo entero o un ratón entero.

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VIII. DAÑO POR RADIACIÓN A TEMPERATURA CRIOGÉNICA

Aunque el almacenamiento criogénico no puede evitar la ionización por radiación o la ruptura de enlaces químicos, el almacenamiento criogénico protege contra el daño por radiación al reducir la movilidad y la reactividad de las especies reactivas generadas por la radiación [ ULTRAMICROSCOPIA; Knopek,E; 10(1-2):71-86 (1982) ]. Se ha demostrado que el enfriamiento de compuestos orgánicos hidratados moleculares grandes a temperatura criogénica aumenta la exposición tolerable a la radiación ionizante hasta diez veces en microscopía electrónica [ JOURNAL OF MICROSCOPY; Glaeser, RM; 112(1):127-138 (1978) ]. Las células almacenadas en nitrógeno líquido sometidas a radiación ionizante cien veces los niveles de fondo normales no muestran un aumento en la muerte celular, ni hay evidencia de cambios cromosómicos o genéticos después del almacenamiento en nitrógeno líquido.REVISTA AMERICANA DE FISIOLOGÍA; Mazur,P; 247 (3 Pt 1): C125-C142 (1984) ]. Embriones de ratón congelados de 8 células sometidos al equivalente de 2000 años de rayos gamma de fondo durante 5 a 8 meses en nitrógeno líquido no mostraron ningún efecto perjudicial sobre la supervivencia o el desarrollo [ JOURNAL OF REPRODUCTION AND FERTILITY; Glenister, PH; 70(1):229-234 (1984) ]. Los fibroblastos de ovario de hámster chino en DMSO al 10 % muestran 3,5 veces menos daño por  irradiación de rayos X de 600 rad a temperatura de nitrógeno líquido en comparación con 22 ºC [ CRIOBIOLOGÍA; Ashwood-Smith,MJ; 16(2):132-140 (1979)].

La enzima acetilcolinesterasa sometida a irradiación de rayos X muestra cambios conformacionales a -118 ºC, pero ningún cambio conformacional cuando se irradia a -173 ºC [ PROTEIN SCIENCE; Weik,M; 10(10):1953-1961 (2001) ]. La irradiación con rayos X de cristales de insulina y elastasa resultó en un daño cuatro veces mayor a los puentes disulfuro a -173 ºC en comparación con -223 ºC [ ACTAS DE LA ACADEMIA NACIONAL DE CIENCIAS (EE. UU.); Cumple,A; 107(3):1094-1099 (2010) ]. Otro estudio mostró una extensión de la vida útil de la difracción del cristal del 25 % para los cristales de D-xilosa isomerasa irradiados con rayos X a menos de -253 ºC en comparación con los irradiados a -173 ºC [ ACTA CRYSTALLOGRAPHICA; Chinte,U; 63 (parte 4): 486-492 (2007)]. No obstante, otro estudio mostró diferencias insignificantes entre muestras biológicas hidratadas congeladas sometidas a radiación de rayos X a temperaturas entre −269ºC y −173ºC [ JOURNAL OF STRUCTURAL BIOLOGY; Bammes, BE; 169(3):331-341 (2010) ].

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VIII. ¿ANIMACIÓN SUSPENDIDA PARA VUELO ESPACIAL HUMANO?

Llamar al metabolismo deprimido por el sulfuro de hidrógeno "animación suspendida" es una hipérbole en la medida en que el metabolismo a una décima parte de lo normal todavía está muy por encima de la ausencia de metabolismo. Incluso si la hibernación artificial de los humanos pudiera permitir temperaturas de mantenimiento cercanas a los 0ºC, la tasa metabólica seguiría siendo una vigésima parte de lo normal. Un vuelo espacial de 200 días requeriría 10 días de manejo de nutrientes, oxígeno y desechos para un mamífero que hiberna a 0ºC. Por el contrario, si la crioconservación humana fuera posible a temperaturas criogénicas, los minutos de metabolismo a temperaturas corporales normales llevarían decenas o cientos de miles de años [ INVESTIGACIÓN DE REJUVENECIMIENTO; Mejor,B; 11(2):493-503 (2008)]. Además, la crioconservación a temperatura criogénica brindaría una protección mucho mayor contra el daño por radiación. Mantener la temperatura criogénica en el espacio podría requerir cantidades modestas de energía.

La toxicidad de los crioprotectores que utilizan crioprotectores convencionales sigue siendo el mayor obstáculo para la vitrificación de órganos más grandes que un riñón de conejo [ CRIOBIOLOGÍA; Fahy, GM; 6 de junio de 2009 ]. Si pudiera eliminarse la toxicidad de los crioprotectores, sería posible la crioconservación reversible a temperatura criogénica de un ser humano completo. Alternativamente, si se pudiera inducir a todas las células humanas a producir un crioprotector no tóxico como la trehalosa (que no atraviesa las membranas celulares), podría ser posible la vitrificación de todo el cuerpo. Ya se ha inducido a fibroblastos humanos para que sinteticen trehalosa crioprotectora mediante genes introducidos utilizando vectores de adenovirus recombinantes  [ NATURE BIOTECHNOLOGY; Guo,N; 18(2):168-171 (2000) ].

La criónica es la crioconservación de seres humanos legalmente muertos a temperaturas criogénicas con la esperanza de que la tecnología futura no solo repare los daños resultantes de la crioconservación, sino que también cure todas las enfermedades y rejuvenezca a las personas hasta la flor de la vida. La criónica, tal como se practica hoy en día, utiliza la vitrificación, pero aunque el hielo se puede eliminar en muchos órganos, el daño se produce por la toxicidad de los crioprotectores. También puede haber daño por congelación debido a la perfusión incompleta de ciertos órganos o tejidos. Se espera que la nanotecnología ( nanomedicina ) sea capaz de reparar daños a nivel molecular. La tecnología del futuro no es ciencia, pero no se debe descartar la idea de que la tecnología del futuro será muy superior a la tecnología actual.

El énfasis de la tecnología actual en criónica es criopreservar con la menor cantidad de daño para que la tecnología futura tenga la mejor oportunidad de reparar el daño. Aunque alguna futura tecnología de reparación molecular podría reparar el daño, es más prudente minimizar el daño en primer lugar. Por lo tanto, las organizaciones de criónica primero perfunden a los pacientes de criónica con crioprotectores anticongelantes para eliminar el hielo por completo (vitrificación). Las micrografías electrónicas de tejido cerebral vitrificado al menos indican que la estructura del cerebro se puede preservar en un nivel fino, lo que hace que la futura reparación molecular sea más prometedora.

Los seres humanos en los vuelos espaciales no necesitarían rejuvenecimiento ni la curación de enfermedades fatales, ni debería haber ningún proceso de reparación requerido por la toxicidad de los crioprotectores o el daño por congelación. Si se desarrollara algo para aumentar la conductividad térmica de los tejidos, se podrían usar crioprotectores menos tóxicos porque sería factible un enfriamiento externo más rápido. Alternativamente, algo como una tecnología de microondas inversa para enfriar en lugar de calentar podría tener algún beneficio.

El agua pura puede vitrificarse sin crioprotectores si se enfría a 3 millones de grados centígrados por segundo [ JOURNAL OF MICROSCOPY; Calvo, WB; 143 (Pt 1): 89-102 (1986) ]. Tal velocidad de enfriamiento no sería práctica para tejidos de mamíferos, al menos parcialmente porque el enfriamiento se aplicaría externamente. Si pudiera inventarse algo que actuara como un microondas inverso que enfría el tejido uniformemente de la misma manera que el calentamiento por microondas calienta uniformemente, se podría usar menos crioprotector. La desmagnetización adiabática es algo así como un efecto de microondas inverso. Un paciente de criónica podría perfundirse con una solución compuesta no solo de crioprotector sino también de una sal paramagnética como el alumbre de amonio férrico.en un campo magnético. Al disminuir gradualmente la fuerza del campo magnético, los iones de sal se desordenan, atrayendo uniformemente el calor por todo el cuerpo del paciente criónico, no solo desde la superficie. Este u otros mecanismos novedosos de enfriamiento podrían ser potencialmente de gran beneficio para resolver el problema del enfriamiento rápido de grandes objetos biológicos.

Las microondas rotan las moléculas de agua para generar calor , y esta tecnología se ha utilizado para mejorar la uniformidad de la temperatura durante el recalentamiento de los tejidos vitrificados [ CRIOBIOLOGÍA; Wusterman,M; 48(2):179-189 (2004) y FÍSICA EN MEDICINA Y BIOLOGÍA; Robinson, parlamentario; 47(13):2311-2325 (2002) ]. Se ha utilizado un campo eléctrico oscilante para reducir la cantidad de hielo que se forma al sumergir muestras de 1,5 microlitros de etilenglicol (EG) en nitrógeno líquido. La formación de hielo se redujo aproximadamente un 56 % para una solución de EG de 3,5 molar y se redujo aproximadamente un 66 % para una solución de EG de 4,5 molar [ CRIOBIOLOGÍA; Jackson,JH; 34(4):363-372 (1997) ]. Una aplicación japonesa llamada Cells Alive System (CAS)  [ SCIENCE LINKS JAPAN; episodio 21; abi inc] utiliza un campo eléctrico giratorio en el procesamiento de alimentos [ PATENTE 6,250,087; Norio Owada y Satoru Kurita y PATENTE 7.237.400; Norio Owada ]. Por qué funciona este efecto es un tema de controversia, pero se sabe que los campos eléctricos estáticos mejoran la nucleación del hielo [ GEOFÍSICA PURA Y APLICADA; Pruppacher,HR; 104(1):623-634 (1973) ], por lo que quizás los campos eléctricos oscilantes tengan el efecto contrario. Otro grupo japonés informó que sometió ovarios de rata a un campo magnético durante el enfriamiento y observó una mejor crioconservación que los controles, a pesar de la ausencia de crioprotector [ COLABORACIONES ACADÉMICAS PARA NIÑOS ENFERMOS; Mihara,M; 1:34-37 (2009)]. Si estas, o tecnologías similares, pudieran perfeccionarse para permitir la vitrificación con poco o ningún crioprotector, la preservación criogénica de órganos y la animación suspendida humana a través de la crioconservación a temperaturas criogénicas podrían ser posibles.

 
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