La criopreservación como medio de Animación Suspendida

 

por Ben Mejor

CONTENIDOS: ENLACES A SECCIONES

1. CRIPTOBIOSIS
2. HIBERNACIÓN
3. METABOLISMO DEPRIMIDO INDUCIDO
4. METABOLISMO DISMINUIDO CON ENFRIAMIENTO
5. PEQUEÑOS ANIMALES QUE SOBREVIVEN A LA TEMPERATURA CRIOGÉNICA
6. VITRIFICACIÓN DE MAMÍFEROS
7. DAÑO POR RADIACIÓN A TEMPERATURA CRIOGÉNICA
8. ¿ANIMACIÓN SUSPENDIDA PARA VUELO ESPACIAL HUMANO?

I. CRIPTOBIOSIS

La criptobiosis es un estado de metabolismo detenido por un organismo que protege contra ambientes hostiles, como sequía, hambruna, falta de oxígeno o temperatura extrema [ BIOQUÍMICA Y FISIOLOGÍA COMPARATIVA; PARTE B; Clegg,JS; 128(4):613-624 (2001) ]. Mecanismos fisiológicos similares asociados con la protección criptobiótica contra la deshidratación y el frío se encuentran tanto en plantas como en animales [ JOURNAL OF EXPERIMENTAL BIOLOGY; Piso, KB; 210 (Pt 10): 1700-1714 (2004) ]. Las proteínas abundantes en embriogénesis tardía (LEA) protegen tanto a las plantas como a las proteínas animales de la sequía, el frío y el estrés osmótico [ BIOCHEMICAL JOURNAL; Goyal,K; 388 (parte 1): 151-157 (2005)]. Las proteínas de choque frío, las proteínas anticongelantes, los agentes nucleadores de hielo y los crioprotectores, junto con las proteínas LEA, son los principales mecanismos bioquímicos que permiten que las plantas y los animales resistan temperaturas bajo cero [ NATURWISSENSCHAFTEN; Margesin,R; 94(2):77-00 (2007) ].

Las bacterias Pseudomonas y Escherichia coli pueden sobrevivir congeladas a la temperatura del nitrógeno líquido sin sufrir mutaciones [ CRIOBIOLOGY; Ashwood-Smith,MJ; 2(1):39-43 (1965) ], pero los organismos multicelulares no son tan resistentes. Los artrópodos polares sobreviven a temperaturas bajo cero mediante la deshidratación y la producción de azúcares de bajo peso molecular y alcoholes de azúcar que actúan como crioprotectores [ JOURNAL OF INSECT FISIOLOGY; Worland,MR; 49(3):193-203 (2003) ]. Algunas especies pueden tolerar la congelación extracelular. El único animal conocido que sobrevive a la congelación intracelular es el nematodo antártico Panagrolaimus davidi . Panagrolaimus davidisometidas experimentalmente a congelación rápida, se formó un 54 % de hielo intracelular, pero sobrevivió un 53 % [ CRIOBIOLOGÍA; Warton, DA; 50(1):21-28 (2005) ].

(volver a contenidos)

II. HIBERNACIÓN

Las marmotas en hibernación mantienen una temperatura corporal de 5ºC en temperaturas ambientales tan bajas como −1ºC [ FISIOLOGÍA RESPIRATORIA Y NEUROBIOLOGÍA; Heldmaier,G; 141(3):317-329 (2004) ]. Se ha demostrado que las ardillas terrestres del Ártico hibernan durante al menos dos meses a temperaturas de hasta -2,9 ºC sin congelarse [ CIENCIA; Barnes,BM; 244:1593-1595 (1989) ].

Los animales de sangre caliente que no hibernan sufren efectos adversos cuando se les somete a temperaturas por debajo de los 28 ºC, incluidos escalofríos extremos, alta viscosidad de la sangre y paro cardíaco [ JOURNAL OF THE AMERICAN VETERINARY ASSOCIATION; Luna, PF; 202(3):437-444 (1993) ]. Se han realizado esfuerzos farmacológicos para reducir el umbral de escalofríos y la termorregulación natural contundente en humanos para aumentar los beneficios de la hipotermia terapéutica [ STROKE; Sessler, DI; 40(11):e614-e621 (2009) ]. Aunque los osos son capaces de tener un metabolismo deprimido, la temperatura de su cuerpo permanece por encima de los 30 ºC, y algunos escalofríos ayudan a mantener la fuerza muscular y la temperatura [ AMERICAN JOURNAL OF FISIOLOGÍA; McGee-Lawrence, ME; 295(6):R1999-R2014 (2008) ].

Se han realizado varios estudios de proteínas y expresión génica en mamíferos en hibernación [ MOLECULAR & CELLULAR PROTEOMICS; Shao,C; 9(2):313-326 (2010) y TENDENCIAS EN ENDOCRINOLOGÍA Y METABOLISMO; Melvin, RG; 20(10):490-498 (2009) ]. Es probable que los genes de los mamíferos en hibernación se conserven en el genoma humano, de modo que la inducción de estos genes podría ser un medio para colocar a los humanos en un estado de "animación suspendida" [ BIOENSAYS; Andrews, MT; 29(5):431-440 (2007) ].

(volver a contenidos)

tercero METABOLISMO DEPRIMIDO INDUCIDO

En condiciones anóxicas, los embriones de pez cebra ( Danio rerio ) entran en un estado de animación suspendida reversible caracterizado por un latido cardíaco detenido y una progresión del ciclo celular detenida [ ACTAS DE LA ACADEMIA NACIONAL DE CIENCIAS (EE.UU.); Padillo, PA; 98(13):7331-7335 (2001) ]. Los nematodos Caenorhabditis elegans (que responden a la anoxia entrando en animación suspendida y sobreviven a la hipoxia deprimiendo el metabolismo con el factor 1 inducible por hipoxia ), pueden ser inducidos a un estado de animación suspendida con monóxido de carbono [ PROCEEDINGS OF THE NATIONAL ACADEMIA OF SCIENCIAS (EE. UU.); nistul, TG; 101(24):9133-9136 (2004)]. El factor inducible por hipoxia no solo deprime el metabolismo, sino que también deprime los mecanismos apoptóticos [ ANTIOXIDANTS & REDOX SIGNALLING; Snyder, CM; 11(11):2673-2683 (2009) ]. C. elegans con exposición de por vida al sulfuro de hidrógeno tiene una vida media aumentada en un 70 %, pero sin ninguna reducción aparente en la tasa metabólica [ ACTAS DE LA ACADEMIA NACIONAL DE CIENCIAS (EE. UU.); Miller,DL; 104(51):20618-20622 (2007) ].

La ardilla terrestre de manto dorado Spermophilus lateralis es un mamífero en hibernación que puede ser inducido por hipoxia a un estado de metabolismo deprimido y temperatura corporal reducida [ JOURNAL OF APPLIED FISIOLOGY; Barros,RCH; 91(2):603-612 (2001) ]. También se ha demostrado que la hipoxia reduce el metabolismo en pequeños mamíferos que no hibernan [ AMERICAN JOURNAL OF PHYSIOLOGY; Frapell,P; 262(6 Pt 2):R1040-R1046 (1992) ], pero la hipoxia no parece tener este efecto en los grandes mamíferos [ JOURNAL OF APPLIED FISIOLOGY; Korducki,MJ; 76(6):2380-2385 (1994) ].

El ratón, un mamífero que no hiberna, puede ser inducido con sulfuro de hidrógeno a entrar en un estado de "animación suspendida" que reduce la tasa metabólica en un 90% y deja la temperatura corporal central solo 2ºC por encima de una temperatura ambiente de 13ºC [ CIENCIA; Blackstone,E; 308:518 (2005) ]. Se cree que este efecto se debe a la inhibición del sulfuro de hidrógeno de la citocromo c oxidasa en las mitocondrias, inhibiendo así la fosforilación oxidativa. Se ha producido un efecto similar en ratas usando concentraciones más altas de sulfuro de hidrógeno [ THE JOURNAL OF TRAUMA; Morrison, ML; 65(1):183-188 (2008) ], aunque otro estudio fracasó en deprimir el metabolismo en ratas usando sulfuro de hidrógeno [ RESPIRATORY FISIOLOGÍA & NEUROBIOLOGÍA; Haouzi,P; 167(3):316-322 (2009)]. Algunos investigadores no lograron deprimir el metabolismo con sulfuro de hidrógeno en ovejas [ FISIOLOGÍA RESPIRATORIA Y NEUROBIOLOGÍA; Haouzi,P; 160(1):109-115 (2008) ] o lechones [ MEDICINA DE CUIDADOS CRÍTICOS PEDIÁTRICOS; Zhang,LJ; 9(1):110-112 (2008) ], mientras que otros investigadores lograron reducir el metabolismo y la temperatura en cerdos [ SHOCK; Simón,F; 30(4):359-364 (2008) ].

Recientemente se ha sugerido la inducción de un metabolismo deprimido (hibernación) en mamíferos (incluidos los humanos) con la proteína quinasa activada por AMP [ REVISIÓN ANUAL DE MEDICINA; Lee, CC; 59:177-186 (2008) ].

(volver a contenidos)

IV. METABOLISMO DISMINUIDO CON ENFRIAMIENTO

Cuando los animales bajan la temperatura corporal su tasa metabólica se reduce casi a la mitad por cada 10ºC de descenso entre 40ºC (temperatura corporal aproximada) y 0ºC [ JOURNAL OF BIOENERGETICS; Razón, JK; 4(1):285-309 (1973) y NATURE; Davidson,EA; 440:165-173 (2006) ]. Las personas, especialmente los niños, que se han caído en agua fría han sido protegidas por hipotermia de un posible daño cerebral después de que su corazón haya estado detenido durante una hora [ JOURNAL OF THE AMERICAN MEDICAL ASSOCIATION; Bolte,RG; 260(3):377-379 (1988) ]. Una niña de 31 meses sin pulso que había pasado casi seis horas a temperaturas exteriores por debajo de -20ºC y tenía una temperatura rectal de 14ºC sobrevivió con una recuperación neurológica completa [ THE JOURNAL OF TRAUMA; Dobson,JA; 40(3):483-485 (1996)].

Los perros enfriados a 34ºC después de diez minutos de fibrilación ventricular inducida pudieron sobrevivir 60 minutos de fibrilación ventricular con buen resultado neurológico [ CIRCULACIÓN; Nozari,A; 113(23):2690-2696 (2006) ]. Se ha demostrado que la hipotermia modula las concentraciones cerebrales de proteínas pro y antiapoptóticas a favor de la prevención de la muerte celular neuronal [ ACTA ANAESTHESIOLOGICA SCANDINAVIA; Eberspacher,E; 49(4):477-487 (2005) ]. Una revisión de modelos animales de accidente cerebrovascular isquémico encontró que el volumen del infarto se redujo en aproximadamente un tercio al enfriar a 35 °C dentro de los 90 a 180 minutos posteriores al inicio del tratamiento permanente [ BRAIN; van der Worp,HB; 130 (parte 2): 3063-3074 (2007)]. En un estudio con cerdos, la mayoría de los cerdos enfriados a 10ºC sobrevivieron hasta 60 minutos de shock sin efectos neurológicos [ CIRUGÍA; Alam, HB; 132(2):278-288 (2002) ]. Seis de seis perros hipotérmicos experimentales que tenían una temperatura timpánica de 10ºC soportaron 90 minutos de paro cardíaco sin daño neurológico subsiguiente, y dos de siete aguantaron 120 minutos sin daño neurológico evidente [ MEDICINA DE CUIDADOS CRÍTICOS; Behringer,W; 31(5):1523-1531 (2003) ]. Los perros que recibieron perfusión sanguinolenta continua pudieron recuperarse de al menos cuatro horas por debajo de los 9 ºC y dos horas por debajo de los 5 ºC con una recuperación neurológica satisfactoria [ SITIO WEB DE ALCOR; hipotermia ultraprofunda sanguinolenta; hoja, JD; Darwin,MG; (1987) ].

Las víctimas humanas de fibrilación ventricular sometidas a solo 1ºC de hipotermia mostraron un aumento sustancial tanto en la supervivencia como en el resultado neurológico favorable [ MEDICINA DE CUIDADOS CRÍTICOS; Don,CW; 37(12):3062-3069 (2009) ]. Los seres humanos han sido sometidos a un paro cardíaco hipotérmico profundo para cirugía aórtica durante más de una hora sin déficits neurológicos graves. Los sujetos alcanzaron un silencio electrocerebral completo (índice biespectral electroencefalográfico cero) entre temperaturas de 16ºC y 24ºC [ REVISTA DE ANESTESIA CARDIOTORÁCICA Y VASCULAR; Hayashida,M; 21(1):61-67 (2007) ] y se recalentaron sin déficit neurológico, lo que confirma que la actividad cerebral dinámica se puede perder y recuperar sin pérdida de identidad personal.

Muchos reptiles e invertebrados pueden soportar temperaturas más bajas que los mamíferos y, por lo tanto, alcanzan un estado más profundo de metabolismo deprimido y animación suspendida. La rana de madera del norte ( Rana sylvatica ) puede sobrevivir en un estado semicongelado hasta -6ºC durante meses con una recuperación completa al recalentarse [ THE FASEB JOURNAL; Costanzo, JP; 9(5):351-358 (1995) ].

(volver a contenidos)

V. PEQUEÑOS ANIMALES QUE SOBREVIVEN A LA TEMPERATURA CRIOGÉNICA

Se ha demostrado que las larvas del escarabajo de Alaska Cucujus clavipes puniceus sobreviven a temperaturas de hasta -100ºC [ THE JOURNAL OF EXPERIMENTAL BIOLOGY; Sformo,T; 213 (Pt 3):502-509 (2010) ]. La capacidad de alcanzar un estado anhidrobiótico (desecado) permite que algunos organismos toleren naturalmente las temperaturas criogénicas. Las larvas del quironómido africano Polypedilum vanderplanki , el animal multicelular más grande capaz de anhidrobiosis (el único insecto capaz de anhidrobiosis) supuestamente sobreviven a temperaturas tan bajas como -270ºC [ JOURNAL OF EXPERIMENTAL BIOLOGY; Watanabe,M; 206 (Pt 13): 2281-2286 (2003)]. La vitrificación por trehalosa y proteína ha demostrado ser esencial para la anhidrobiosis de los quironómidos [ ACTAS DE LA ACADEMIA NACIONAL DE CIENCIAS (EE.UU.); Sakarai,M; 105(13):5093-5098 (2008) ]. Los tardígrados , que son animales microscópicos similares a los artrópodos capaces de sufrir anhidrobiosis, pueden sobrevivir al enfriamiento a la temperatura del nitrógeno líquido (−196 ºC) incluso en un estado hidratado [ CRIOBIOLOGÍA; Ramlov,H; 29(1):125-130 (1992) ].

Los animales multicelulares tratados con crioprotectores han sobrevivido al enfriamiento a temperaturas criogénicas. Una variedad de helmintos parásitos han sobrevivido al almacenamiento en nitrógeno líquido después del tratamiento con DMSO, glicerol o etilenglicol [ CRIOBIOLOGY; James,ER; 49(3):201-210 (2004) ].

Muchas variedades de larvas de nematodos han sobrevivido a temperaturas criogénicas. El nematodo C. elegans se almacena rutinariamente en nitrógeno líquido . Los nematodos de plantas tratados con etilenglicol al 25 %, enfriados rápidamente y mantenidos en nitrógeno líquido durante unos minutos antes de almacenarlos en un congelador a -140 ºC durante un mes, mostraron una supervivencia del 85 % [ CRIOBIOLOGÍA; Irdani,T; 52(3):319-322 (2006) ]. Se lograron tasas de supervivencia de hasta el 70 % para larvas de nematodos parásitos tratadas con 10 % de DMSO antes de 16 meses de almacenamiento en nitrógeno líquido [ REVISTA INTERNACIONAL DE PARASITOLOGÍA; branquia,JH; 25(12):1421-1426 (1995)]. La mayoría de una variedad de larvas de especies de nematodos infecciosos tratadas con hipoclorito de sodio y solución salina sobrevivieron más de 15 años en nitrógeno líquido, aunque el porcentaje de infectividad fue menos de la mitad del porcentaje de supervivencia [ PARASITOLOGÍA VETERINARIA; van Wyk, JA; 88(3-4):239-247 (2000) ]. El nematodo parásito tropical sensible al estrés Radopholus similis tratado con una mezcla de metanol, glicerol y glucosa no mostró reducción de la infectividad o reproducción después del almacenamiento en nitrógeno líquido [ CRIOBIOLOGY; Elsen,A; 55(2):148-157 (2007) ].

La supervivencia completa (100%) de los juveniles infectados por nematodos entomopatógenos se logró después del tratamiento con glicerol y solución de Ringer antes de la conservación en nitrógeno líquido [ JOURNAL OF NEMATOLOGY; Bai,C; 36(3):281-284 (2004) ]. Se logró una supervivencia del 27 % para las larvas de anquilostomiasis humana ( Ancyclostoma ceylanicum ) tratadas con una solución de DMSO al 10 % y dextrano al 10 % antes de los 100 días en nitrógeno líquido [ AMERICAN JOURNAL OF TROPICAL MEDICAL HYGIENE; Duarte,J; 68(1):44-45 (2003) ]. Más del 50 % de las larvas de gusanos de trapo ( Nereis virens ) tratadas con 10 % de DMSO sobrevivieron al almacenamiento con nitrógeno líquido [ CRIOBIOLOGÍA; oliva,JW; 34(3):284-294 (1997)]. Del 60 al 70 % de los embriones de mosca de la fruta de 50 000 células ( Drospophila melanogaster ) vitrificados con etilenglicol y enfriados a -205 ºC eclosionaron tras el recalentamiento, y el 40 % de las larvas se convirtieron en adultos fértiles [ CIENCIA; Mazur,P; 258:1932-1935 (1992) ].

(volver a contenidos)

VI. VITRIFICACIÓN DE MAMÍFEROS

El hielo ocupa un 9% más de volumen que el agua. Aunque es un error pensar que el agua revienta las células al congelarse en su interior , es cierto que la expansión del hielo en el espacio extracelular aplasta las células [ AMERICAN JOURNAL OF PHYSIOLOGY; Mazur,P; 247 (3 Pt 1): C125-C142 (1984) ]. La vitrificación lograda mediante la adición de suficiente crioprotector puede eliminar la formación de hielo durante el enfriamiento de tejidos biológicos a temperaturas criogénicas.

Se han vitrificado con éxito varios tejidos y órganos de mamíferos. Los vasos sanguíneos creados por ingeniería tisular vitrificados, almacenados a -135 ºC y recalentados mostraron una actividad metabólica comparable a los controles frescos [ TISSUE ENGINEERING; Dahl,SLM; 12(2):291-300 (2006) ]. Cortes de hipocampo de rata vitrificados, enfriados a -130ºC y recalentados mostraron 100% de viabilidad dentro del margen de error experimental [ CRIOBIOLOGY; Pichugin,Y; 52(2):228-240 (2006) ]. La tráquea de conejo que se vitrificó, se mantuvo en nitrógeno líquido y se recalentó fue comparable a las muestras frescas [ CRIOBIOLOGY; Xu,H; 58(2):225-231 (2009) ]. Se vitrificaron ovarios completos de ratón, se almacenaron en nitrógeno líquido y se recalentaron para producir tasas de natalidad de crías vivas comparables a las observadas con ovarios frescos.FERTILIDAD Y ESTERILIDAD; Hasegawa,A; 86 (Suplemento 3): 1182-1192 (2006) ].

El mayor logro de la vitrificación hasta la fecha ha sido la vitrificación de un riñón de conejo, enfriamiento a -135ºC, recalentamiento, retrasplante en el conejo y el riñón capaz de mantener al conejo indefinidamente como el único riñón funcional [ ORGANOGÉNESIS; Fahy, GM; 5(3):167-175 (2009) ]. Pero esto está muy lejos de vitrificar un conejo entero o un ratón entero.

(volver a contenidos)

VIII. DAÑO POR RADIACIÓN A TEMPERATURA CRIOGÉNICA

Aunque el almacenamiento criogénico no puede evitar la ionización por radiación o la ruptura de enlaces químicos, el almacenamiento criogénico protege contra el daño por radiación al reducir la movilidad y la reactividad de las especies reactivas generadas por la radiación [ ULTRAMICROSCOPIA; Knopek,E; 10(1-2):71-86 (1982) ]. Se ha demostrado que el enfriamiento de compuestos orgánicos hidratados moleculares grandes a temperatura criogénica aumenta la exposición tolerable a la radiación ionizante hasta diez veces en microscopía electrónica [ JOURNAL OF MICROSCOPY; Glaeser, RM; 112(1):127-138 (1978) ]. Las células almacenadas en nitrógeno líquido sometidas a radiación ionizante cien veces los niveles de fondo normales no muestran un aumento en la muerte celular, ni hay evidencia de cambios cromosómicos o genéticos después del almacenamiento en nitrógeno líquido.REVISTA AMERICANA DE FISIOLOGÍA; Mazur,P; 247 (3 Pt 1): C125-C142 (1984) ]. Embriones de ratón congelados de 8 células sometidos al equivalente de 2000 años de rayos gamma de fondo durante 5 a 8 meses en nitrógeno líquido no mostraron ningún efecto perjudicial sobre la supervivencia o el desarrollo [ JOURNAL OF REPRODUCTION AND FERTILITY; Glenister, PH; 70(1):229-234 (1984) ]. Los fibroblastos de ovario de hámster chino en DMSO al 10 % muestran 3,5 veces menos daño por  irradiación de rayos X de 600 rad a temperatura de nitrógeno líquido en comparación con 22 ºC [ CRIOBIOLOGÍA; Ashwood-Smith,MJ; 16(2):132-140 (1979)].

La enzima acetilcolinesterasa sometida a irradiación de rayos X muestra cambios conformacionales a -118 ºC, pero ningún cambio conformacional cuando se irradia a -173 ºC [ PROTEIN SCIENCE; Weik,M; 10(10):1953-1961 (2001) ]. La irradiación con rayos X de cristales de insulina y elastasa resultó en un daño cuatro veces mayor a los puentes disulfuro a -173 ºC en comparación con -223 ºC [ ACTAS DE LA ACADEMIA NACIONAL DE CIENCIAS (EE. UU.); Cumple,A; 107(3):1094-1099 (2010) ]. Otro estudio mostró una extensión de la vida útil de la difracción del cristal del 25 % para los cristales de D-xilosa isomerasa irradiados con rayos X a menos de -253 ºC en comparación con los irradiados a -173 ºC [ ACTA CRYSTALLOGRAPHICA; Chinte,U; 63 (parte 4): 486-492 (2007)]. No obstante, otro estudio mostró diferencias insignificantes entre muestras biológicas hidratadas congeladas sometidas a radiación de rayos X a temperaturas entre −269ºC y −173ºC [ JOURNAL OF STRUCTURAL BIOLOGY; Bammes, BE; 169(3):331-341 (2010) ].

(volver a contenidos)

VIII. ¿ANIMACIÓN SUSPENDIDA PARA VUELO ESPACIAL HUMANO?

Llamar al metabolismo deprimido por el sulfuro de hidrógeno "animación suspendida" es una hipérbole en la medida en que el metabolismo a una décima parte de lo normal todavía está muy por encima de la ausencia de metabolismo. Incluso si la hibernación artificial de los humanos pudiera permitir temperaturas de mantenimiento cercanas a los 0ºC, la tasa metabólica seguiría siendo una vigésima parte de lo normal. Un vuelo espacial de 200 días requeriría 10 días de manejo de nutrientes, oxígeno y desechos para un mamífero que hiberna a 0ºC. Por el contrario, si la crioconservación humana fuera posible a temperaturas criogénicas, los minutos de metabolismo a temperaturas corporales normales llevarían decenas o cientos de miles de años [ INVESTIGACIÓN DE REJUVENECIMIENTO; Mejor,B; 11(2):493-503 (2008)]. Además, la crioconservación a temperatura criogénica brindaría una protección mucho mayor contra el daño por radiación. Mantener la temperatura criogénica en el espacio podría requerir cantidades modestas de energía.

La toxicidad de los crioprotectores que utilizan crioprotectores convencionales sigue siendo el mayor obstáculo para la vitrificación de órganos más grandes que un riñón de conejo [ CRIOBIOLOGÍA; Fahy, GM; 6 de junio de 2009 ]. Si pudiera eliminarse la toxicidad de los crioprotectores, sería posible la crioconservación reversible a temperatura criogénica de un ser humano completo. Alternativamente, si se pudiera inducir a todas las células humanas a producir un crioprotector no tóxico como la trehalosa (que no atraviesa las membranas celulares), podría ser posible la vitrificación de todo el cuerpo. Ya se ha inducido a fibroblastos humanos para que sinteticen trehalosa crioprotectora mediante genes introducidos utilizando vectores de adenovirus recombinantes  [ NATURE BIOTECHNOLOGY; Guo,N; 18(2):168-171 (2000) ].

La criónica es la crioconservación de seres humanos legalmente muertos a temperaturas criogénicas con la esperanza de que la tecnología futura no solo repare los daños resultantes de la crioconservación, sino que también cure todas las enfermedades y rejuvenezca a las personas hasta la flor de la vida. La criónica, tal como se practica hoy en día, utiliza la vitrificación, pero aunque el hielo se puede eliminar en muchos órganos, el daño se produce por la toxicidad de los crioprotectores. También puede haber daño por congelación debido a la perfusión incompleta de ciertos órganos o tejidos. Se espera que la nanotecnología ( nanomedicina ) sea capaz de reparar daños a nivel molecular. La tecnología del futuro no es ciencia, pero no se debe descartar la idea de que la tecnología del futuro será muy superior a la tecnología actual.

El énfasis de la tecnología actual en criónica es criopreservar con la menor cantidad de daño para que la tecnología futura tenga la mejor oportunidad de reparar el daño. Aunque alguna futura tecnología de reparación molecular podría reparar el daño, es más prudente minimizar el daño en primer lugar. Por lo tanto, las organizaciones de criónica primero perfunden a los pacientes de criónica con crioprotectores anticongelantes para eliminar el hielo por completo (vitrificación). Las micrografías electrónicas de tejido cerebral vitrificado al menos indican que la estructura del cerebro se puede preservar en un nivel fino, lo que hace que la futura reparación molecular sea más prometedora.

Los seres humanos en los vuelos espaciales no necesitarían rejuvenecimiento ni la curación de enfermedades fatales, ni debería haber ningún proceso de reparación requerido por la toxicidad de los crioprotectores o el daño por congelación. Si se desarrollara algo para aumentar la conductividad térmica de los tejidos, se podrían usar crioprotectores menos tóxicos porque sería factible un enfriamiento externo más rápido. Alternativamente, algo como una tecnología de microondas inversa para enfriar en lugar de calentar podría tener algún beneficio.

El agua pura puede vitrificarse sin crioprotectores si se enfría a 3 millones de grados centígrados por segundo [ JOURNAL OF MICROSCOPY; Calvo, WB; 143 (Pt 1): 89-102 (1986) ]. Tal velocidad de enfriamiento no sería práctica para tejidos de mamíferos, al menos parcialmente porque el enfriamiento se aplicaría externamente. Si pudiera inventarse algo que actuara como un microondas inverso que enfría el tejido uniformemente de la misma manera que el calentamiento por microondas calienta uniformemente, se podría usar menos crioprotector. La desmagnetización adiabática es algo así como un efecto de microondas inverso. Un paciente de criónica podría perfundirse con una solución compuesta no solo de crioprotector sino también de una sal paramagnética como el alumbre de amonio férrico.en un campo magnético. Al disminuir gradualmente la fuerza del campo magnético, los iones de sal se desordenan, atrayendo uniformemente el calor por todo el cuerpo del paciente criónico, no solo desde la superficie. Este u otros mecanismos novedosos de enfriamiento podrían ser potencialmente de gran beneficio para resolver el problema del enfriamiento rápido de grandes objetos biológicos.

Las microondas rotan las moléculas de agua para generar calor , y esta tecnología se ha utilizado para mejorar la uniformidad de la temperatura durante el recalentamiento de los tejidos vitrificados [ CRIOBIOLOGÍA; Wusterman,M; 48(2):179-189 (2004) y FÍSICA EN MEDICINA Y BIOLOGÍA; Robinson, parlamentario; 47(13):2311-2325 (2002) ]. Se ha utilizado un campo eléctrico oscilante para reducir la cantidad de hielo que se forma al sumergir muestras de 1,5 microlitros de etilenglicol (EG) en nitrógeno líquido. La formación de hielo se redujo aproximadamente un 56 % para una solución de EG de 3,5 molar y se redujo aproximadamente un 66 % para una solución de EG de 4,5 molar [ CRIOBIOLOGÍA; Jackson,JH; 34(4):363-372 (1997) ]. Una aplicación japonesa llamada Cells Alive System (CAS)  [ SCIENCE LINKS JAPAN; episodio 21; abi inc] utiliza un campo eléctrico giratorio en el procesamiento de alimentos [ PATENTE 6,250,087; Norio Owada y Satoru Kurita y PATENTE 7.237.400; Norio Owada ]. Por qué funciona este efecto es un tema de controversia, pero se sabe que los campos eléctricos estáticos mejoran la nucleación del hielo [ GEOFÍSICA PURA Y APLICADA; Pruppacher,HR; 104(1):623-634 (1973) ], por lo que quizás los campos eléctricos oscilantes tengan el efecto contrario. Otro grupo japonés informó que sometió ovarios de rata a un campo magnético durante el enfriamiento y observó una mejor crioconservación que los controles, a pesar de la ausencia de crioprotector [ COLABORACIONES ACADÉMICAS PARA NIÑOS ENFERMOS; Mihara,M; 1:34-37 (2009)]. Si estas, o tecnologías similares, pudieran perfeccionarse para permitir la vitrificación con poco o ningún crioprotector, la preservación criogénica de órganos y la animación suspendida humana a través de la crioconservación a temperaturas criogénicas podrían ser posibles.

Read more »

Criónica de alta presión

 

CONTENIDOS: ENLACES A SECCIONES

1. NOTAS INTRODUCTORIAS
2. HIELO Y ALTA PRESIÓN
3. PRESIÓN PARA AYUDAR A LA VITIRIFICACIÓN
4. TESIS DE UN CRIONICISTA ALEMÁN
5. COMENTARIOS DE HUGH HIXON DE LA FUNDACIÓN ALCOR
6. RESPUESTA DE BEN BEST
7. COMENTARIOS DE UN CRIOBIÓLOGO
8. BEN MEJORES RESPUESTAS
9. ALIMENTOS PRESURIZADOS Y CONGELADOS PARA EL PENSAMIENTO DE IGOR ARTYUHOV
10. BEN MEJORES RESPUESTAS

I. OBSERVACIONES INTRODUCTORIAS

El objetivo de la criónica es crioconservar humanos (cuerpos enteros, cabezas o cerebros) para que la tecnología del futuro pueda algún día restaurar a esas personas a una vida joven, libre de enfermedades y de envejecimiento. El medio para este fin es reducir o eliminar el daño causado a los tejidos por el agua congelada. Los crioprotectores (agentes anticongelantes) son los medios habituales para eliminar los cristales de hielo, pero muchos han especulado con el uso de la presión. Muchas de estas especulaciones y discusiones sobre el tema se recogen aquí.

(volver a contenidos)

II. HIELO Y ALTA PRESIÓN

Para fines de criónica, se deben evitar todas las formas de hielo, y la presión es valiosa solo cuando puede reducir la temperatura a la que se forma el hielo. Debido a que el hielo a presión atmosférica (conocido como hielo-I ) es menos denso que el agua, la aplicación de presión reduce el punto de fusión, en aproximadamente 0,55 ºC por cada 80 atmósferas de presión hasta aproximadamente -23 ºC a 2000 atmósferas de presión. Se puede hacer que el hielo en polvo (nieve) se pegue como bolas de nieve debido al derretimiento temporal causado por la aplicación de presión. La presión ayuda a derretir el hielo debajo de las cuchillas de los patines de hielo, formando una capa lubricante (aunque la mayor parte del derretimiento se debe a la fricción). La presión de los glaciares pesados ​​también ayuda al movimiento.

Formas de hielo a temperatura y presión variables

 

Por encima de unas 2.000 atmósferas de presión (unos dos kilobares), el hielo no tiene la misma estructura cristalina que tiene a presiones más bajas. De hecho, por encima de las 2.000 atmósferas hay al menos otras 13 formas cristalinas (designadas con números romanos del II al XIV hasta ahora descubiertas). La probabilidad de nucleación disminuye sin límite para el hielo I con el aumento de la presión, pero el aumento de la presión también aumenta la probabilidad de nucleación del hielo III, por lo que −23 ºC es la temperatura de fusión más baja posible ( T _m ) para cualquier forma de hielo a presiones superiores a 1974 atmósferas. No obstante, a esta presión la temperatura de nucleación homogénea ( T _h) disminuye a -92ºC, y el agua se puede vitrificar a velocidades de enfriamiento razonablemente alcanzables [ REVISIONES QUÍMICAS; 102:2627-2650 (2002) ].

Diferentes estructuras cristalinas resultan de la aplicación de altas presiones que causan una creciente deformación de los enlaces de hidrógeno. En los cristales de hielo-VII y hielo-VIII, cada átomo de oxígeno está rodeado por ocho vecinos más cercanos ( el número de coordinación es 8) a 0,286 nm (en contraste con cuatrovecinos más cercanos a 0.275nm en hielo-I). El hielo-VII y el hielo-VIII son casi el doble de densos que el hielo-I. Los enlaces de hidrógeno se alargan en estos cristales de hielo, pero cada átomo de oxígeno permanece unido a solo cuatro hidrógenos. Los hielos II, VIII y IX no se pueden obtener directamente del agua líquida, sino que solo se pueden obtener enfriando o descomprimiendo los hielos III, V, VI o VII. El hielo cúbico (hielo-Ic) se puede formar enfriando los hielos II, III y V a la temperatura del nitrógeno líquido y luego calentándolos. Ice II se puede llevar a la temperatura del nitrógeno líquido sin cambios en la estructura. Aunque la alta presión puede dar lugar a formas de hielo que no se expanden al congelarse (como lo hace el hielo-I), la separación de fases podría, sin embargo, provocar daños debido a la alta concentración de soluto salino.

La acumulación de moléculas de agua en superficies sólidas a temperaturas muy bajas da como resultado la formación de agua sólida amorfa (no cristalina). Los cometas están compuestos en gran parte de agua sólida amorfa, que es probablemente la forma de agua más abundante en el universo. El agua sólida amorfa de baja densidad ( LDA ) ( "hielo" no cristalino) se puede formar al enfriar el agua líquida a una velocidad de 3 millones de ºC por segundo a -79 ºC. Si el hielo hexagonal ordinario ( hielo Ih ) se enfría a la temperatura del nitrógeno líquido (-196ºC) y se somete a 2 GigaPascales (unas 20.000 atmósferas) de presión, se convierte en un sólido amorfo de alta densidad ( HDA ). Si se calienta a alrededor de -148ºC, el HDA se expandirá repentinamente en LDA [ CIENCIA; Soper, AK; 297(5585):1288-1289 (2002) ].

(Para obtener más detalles sobre los cristales de hielo, consulte Algunas propiedades del hielo ).

(volver a contenidos)

tercero PRESIÓN PARA AYUDAR A LA VITIRIFICACIÓN

La eliminación completa del hielo por vitrificación (la formación de una solidificación amorfa, no cristalina y altamente viscosa) es un elemento clave para la crioconservación de la superficie del cerebro y el cuerpo en la criónica. Los productos químicos de crioconservación se utilizan para evitar la formación de hielo y la alta presión puede ayudar.

La temperatura de congelación del agua pura o mezclada con crioprotector cuando no hay agentes nucleantes se denomina temperatura de congelación homogénea ( T _h ). La temperatura a la que una mezcla crioprotectora se volverá ultraviscosa y se convertirá en un sólido vítreo (vidrio) sin congelarse se denomina temperatura de _transición vítrea ( Tg ).

El hielo amorfo o el agente crioprotector ( CPA ) vitrificado pueden cambiar de un líquido vítreo a un sólido vítreo a una temperatura de transición vítrea (tras un enfriamiento suficientemente rápido) o a una presión de transición vítrea (tras una aplicación de presión suficientemente rápida). A presiones de 2.000 atmósferas a la temperatura del punto de fusión de -23ºC, el agua es tan viscosa como la miel y tiene una temperatura de nucleación homogénea de -92ºC.

T h & T g a medida que aumenta el CPA	T h & T g a medida que aumenta la presión	T h & T g con CPA y presión

El aumento de las concentraciones de agente crioprotector ( CPA ) reducirá la T _h y elevará la T _g . La vitrificación es factible donde se cruzan las curvas de T _h y T _g . Si esta intersección puede ocurrir a concentraciones de crioprotector más bajas, la vitrificación se puede lograr con una toxicidad mínima. Las presiones altas pueden reducir la T _h y elevar la T _g de las soluciones crioprotectoras, lo que permite que las curvas se crucen a concentraciones crioprotectoras más bajas. A unas 1.600 atmósferas de presión, la curva T _h para una concentración de crioprotector al 20 % se cruza con la T_{Curva h} sin crioprotector, lo que significa que no se obtiene ninguna ventaja con el uso de una solución crioprotectora al 20 % por encima de 1600 atmósferas.

Relaciones K + /Na +  (viabilidad) a varias presiones crioprotector 1 atm 1000 atm 1600 atm Ninguna 5.53 0,94 30% de DMSO 5.60 5.17 2.99 30% Propilenglicol 4.26 3.59 2.00

Las altas presiones reducen la viabilidad del tejido, como lo indican las  proporciones intracelulares de K ⁺ /Na ⁺ para los tejidos de la corteza renal sometidos a alta presión. Los crioprotectores, sin embargo, también actúan como baroprotectores, protegiendo contra la pérdida de viabilidad debido a las altas presiones que no superan las 1600 atmósferas. Este efecto se ilustra en la siguiente tabla tomada de [CRIOBIOLOGÍA; Fahy, GM; 21(4):407-426 (1984):

[Para obtener más información sobre la temperatura de transición vítrea, consulte mi ensayo Vitrification in Cryonics .]

(volver a contenidos)

IV. TESIS DE UN CRIONICISTA ALEMÁN

LA TESIS

Un crionicista alemán, que tiene formación en química física, ha sugerido que la alta presión puede ser el mejor medio para eliminar el daño por congelación en la criónica . La siguiente tabla para el agua inspiró su pensamiento:

             Presión Punto de congelación
           (atmósferas) Temperatura (H ₂ O ºC)

           1 0
       1,000 -10
       2,045 -22
       3.420 -17
       6,160 0
       7,390 10
       9,800 25
      13,970 50
      23,000 100
      36,500 175

La relevancia de esta tabla es que a medida que aumenta la presión, el punto de congelación del agua cae a un mínimo de -22 ºC a 2700 atmósferas y luego aumenta a +175 ºC a 36 500 atmósferas. El objetivo principal, sin embargo, es evitar la congelación. Un uso juicioso de alta presión puede ser un medio para lograr la vitrificación.

Formas de hielo para temperatura, presión y volumen específico variables

El crionicista alemán sugiere la aplicación de unas 2.000 atmósferas a un cerebro a una temperatura de unos −20ºC (por encima del punto de congelación) seguido de un aumento repentino de la presión a unas 20.000 atmósferas en menos de un segundo. Esto podría resultar en la rápida conversión del cerebro a un estado sólido sin formación de cristales de hielo.

Luego, la presión podría mantenerse a medida que el cerebro se enfría a una temperatura adecuada (quizás la temperatura ambiente) para el almacenamiento a alta presión a largo plazo. O tal vez el cerebro podría permanecer vitrificado y la presión podría eliminarse después de enfriarlo a temperaturas criogénicas. Un factor crucial en la eliminación (y aplicación) de alta presión serían los factores de estrés (posible agrietamiento u otro daño mecánico) y los cambios de volumen. Sorprendentemente, las cifras que me mostró el crionicista alemán sugieren que para +60ºC a 20.000 atmósferas habría un cambio de volumen muy pequeño para el agua. (En posible contradicción, el agua en el punto crítico, 647,6 K y 217,7 atm, ocupa el 40% del volumen a 0ºC, 1 atm [STP]).

El criobiólogo Dr. Greg Fahy congeló los riñones a 1000 atmósferas y descubrió que esto reducía la viabilidad, un problema que no se encontró a 500 atmósferas. No obstante, el Dr. Fahy no aplicó presión instantáneamente y finalmente liberó la presión, y ambas operaciones fueron potencialmente dañinas. Al Dr. Fahy le preocupaba la viabilidad debido a su trabajo sobre la criopreservación de órganos, mientras que los crionicistas suelen estar más satisfechos con la simple reducción o eliminación del daño estructural. (Más tarde, el Dr. Fahy descubrió que el trabajo para mejorar la eficacia de los crioprotectores es mucho más fructífero y abandonó los métodos de alta presión; consulte las mejores respuestas de Ben a continuación para obtener más detalles). El Dr. Paul Segall sugirió que la toxicidad del nitrógeno podría haber sido el problema.

Hay otros efectos dañinos bajo alta presión. Los fluidos supercríticos (a alta presión) tienen una capacidad de disolución extremadamente alta. El dióxido de carbono a alta presión se usa como fluido supercrítico para solvatar la cafeína de los granos de café, lo que da como resultado un café descafeinado. Si queda alguna porción de fluido a alta presión, puede haber una mayor capacidad de solvatación para ese fluido (es necesario entender el mecanismo de solvatación). La viabilidad a alta presión se reduce por el aumento de la rigidez de la grasa en las membranas celulares (razón por la cual los organismos de aguas profundas tienen más grasa insaturada en sus membranas ) y las proteínas se inactivan por la aglutinación de moléculas de agua alrededor de partículas cargadas y por efectos osmóticos.. Pero ninguno de estos efectos importaría si se logra rápidamente un estado sólido, ya que el objetivo es la biostasis sólida, no un estado vivo (viable) bajo alta presión. Solo el efecto del fluido supercrítico podría ser permanentemente destructivo, pero un estado sólido logrado lo suficientemente rápido podría evitar tal destrucción.

El problema de extraer un cerebro humano del cráneo y mantenerlo viable podría ser difícil, pero hacerlo rápidamente a baja temperatura podría eliminar la necesidad de una perfusión constante. Como ha señalado el crionicista alemán Klaus Reinhard, el investigador japonés I. Suda debió someterse a un procedimiento similar para sus cerebros de gato. Dejar el cerebro en el cráneo puede ser aceptable siempre que no se fracture el cráneo o se colapse el cerebro en la parte superior del cráneo.

Soy tan consciente como cualquiera de que poner un cerebro debajo de un martinete lo hará añicos. Pero los problemas de la criónica de alta presión son más sutiles que eso. La presión de 1 atmósfera es equivalente a 14,7 libras por pulgada cuadrada. Si suma el número de pulgadas cuadradas de piel para una persona típica, eso equivale a decenas de miles de libras de presión. ¿Por qué no estamos todos aplastados? Porque la presión se ejerce en todas las direcciones y, por lo tanto, se "auto iguala".

En el océano, la presión aumenta con la profundidad a una tasa de aproximadamente 1 atmósfera por cada 33 pies. Los cachalotes nadan regularmente a profundidades de 3700 pies (alrededor de 110 atmósferas) y hay peces que viven a profundidades 10 veces mayores (el fondo de la fosa de las Marianas en el Pacífico) a una presión de aproximadamente 1100 atmósferas. El mayor peligro para los animales o los peces ocurre con el cambio de profundidad, especialmente la formación de burbujas de gas debido a la rápida disminución de la presión. El peligro más serio de la alta presión es probablemente el colapso de los pulmones (presión en un espacio de fase gaseosa ).

La aplicación de 20.000 atmósferas a un pie cúbico de agua lo convertiría en un estado sólido, lo que reduciría en gran medida la movilidad molecular. Si el pie cúbico de agua contuviera un cerebro, la igualación de la presión en todas las direcciones podría significar que el cerebro simplemente se convierte en un estado sólido, sin ser "aplastado". Esto supone que todas las partes del cerebro son igualmente comprimibles con agua, lo que probablemente sea una suposición dudosa, a pesar de que el cerebro es principalmente agua y grasa. No obstante, creo que los daños potenciales debidos a la aplicación rápida de presión no pueden ser tan grandes como los causados ​​por daños por congelación.

Me gusta la sencillez de poner repentinamente el cerebro en un estado sólido, pero el hecho de que el calor de la fusión pueda llevar la temperatura a 60ºC (alrededor de 140º Fahrenheit) me perturba. Una temperatura tan alta podría dar lugar fácilmente a reacciones químicas no deseadas, incluso si la movilidad molecular se reduce considerablemente. Creo que lo mismo sería cierto para el almacenamiento a temperatura ambiente a alta presión. Creo que cualquier técnica de alta presión debe combinarse con la técnica de baja temperatura.

El crionicista alemán también sugirió un enfoque de varias etapas. Esto implicaría, digamos, bajar el cerebro/cubo de agua a menos 20ºC a 2000 atmósferas y luego aumentar la presión en una milésima de segundo (no sé de dónde sacó esta cifra) a 6000 atmósferas. Esto podría aumentar la viscosidad y aumentar la temperatura, pero aún a una temperatura bajo cero. Luego, la muestra podría enfriarse nuevamente y el proceso repetirse hasta que se logre un estado vitrificado sólido. Desafortunadamente, no estoy convencido de que este proceso iterativo no resulte en la formación de cristales de hielo; más bien creo que sí.

Creo que el uso inmediato de alta presión prácticamente garantizaría la reducción del daño por congelamiento y una mayor viabilidad. Se espera que un mayor uso de la electromicroscopía en relación con los procedimientos de crioconservación resulte en una mayor apreciación de las distinciones entre mayor y menor daño por congelación.

El daño por congelación no se debe tanto a la "perforación de las células por los cristales de hielo" como al aplastamiento mecánico resultante del hecho de que el hielo es menos denso que el agua, y el hecho de que el agua se congela principalmente en el espacio extracelular. Una presión muy alta podría eliminar la expansión del volumen si se puede aplicar presión tan rápidamente que se evite la formación de cristales de hielo. La transición de fase a un estado sólido producido por el enfriamiento depende de la conducción, lo que significa que necesariamente es tan lenta como para permitir la formación de cristales de hielo. Transición de fase producida por rápidola aplicación de presiones muy altas tiene el potencial de producir vitrificación al no dar tiempo a que se formen cristales de hielo (baja densidad). Es concebible que dicho procedimiento se pueda realizar sin crioprotector y, por lo tanto, sin la toxicidad del crioprotector.

(volver a contenidos)

V. COMENTARIOS DE HUGH HIXON DE LA FUNDACIÓN ALCOR

La publicación de Ben Best sobre la criónica de alta presión contiene algunas suposiciones que podrían tener consecuencias que no creo que haya anticipado.

En primer lugar, la razón por la que se ha propuesto el almacenamiento a alta presión es cerrar la brecha entre las concentraciones de crioprotectores tóxicos y las concentraciones de crioprotectores vitrificables, utilizando los crioprotectores actuales. Otros crioprotectores podrían no tener esta brecha. En segundo lugar, vienen a la mente algunas consideraciones prácticas de ingeniería y física.

Si asumimos la fabricación de una cámara de presión de 22 pulgadas de diámetro utilizando acero con un límite elástico de 100 000 psi y una presión de almacenamiento de 2000 atmósferas (30 000 psi), esto da como resultado una cámara con paredes de 3,3 pulgadas. Esto ignora la práctica de la ingeniería y la cuestión de las propiedades del acero (resistencia industrial) a la temperatura del nitrógeno líquido. Otros problemas son las conexiones eléctricas y de fluidos. En muchos sentidos, esto comienza a parecerse al cañón de una pistola. ¡Un ejemplo reciente de esta escala de fabricación fue el súper cañón de largo alcance de Gerald Bull que estaba desarrollando para Saddam Hussein! En particular, el cierre de este recipiente a presión comienza a parecerse a un bloque de cierre.

Una pregunta que viene a la mente en este punto es: ¿Almacenan a las personas a esta presión? En cuyo caso el costo de almacenamiento por persona será muy elevado. O, dado que a temperaturas lo suficientemente bajas, las formas de hielo de alta presión se pueden almacenar a presión atmosférica, ¿las procesa a -196 ºC y luego las retira en un estado metaestable y las almacena a presión atmosférica en nitrógeno líquido con las consiguientes complicaciones de transferencia? ?

La cristalografía de las formas de hielo de alta presión de los estudios de difracción de rayos X se realizó de esta manera. Los cristales de hielo se formaron a alta presión, se enfriaron a la temperatura del nitrógeno líquido y se retiraron del recipiente a presión a -196 ºC en un estado metaestable y se tomaron radiografías. Desafortunadamente, mucha energía se almacena en el hielo. Probablemente haya en alguna parte un relato anecdótico sobre cómo lidiar con "hielo explosivo".

Podemos estimar la cantidad de energía involucrada en la re-expansión del hielo de la siguiente manera: W = PdV

por lo tanto, 30 000 lb/in ²  X 0,08 in ³ /in ³  = 2 500 in-lb/in ³ que, después de la conversión adecuada, da como resultado un valor de 67 cal/in ³ o 4,2 cal por g.

La capacidad calorífica del hielo a baja temperatura es la siguiente:

 -200ºC 0,156 cal/gr.
 -150ºC .246
 -100ºC .332
  -40ºC .435
    0ºC .492

Suponiendo que la transición tenga lugar a -150 ºC, el salto de temperatura de la energía liberada será de aproximadamente 17 ºC "a martillo" (¡intenta golpear un trozo de hierro hasta que esté demasiado caliente para tocarlo!)

Para 14.000 atmósferas (otra cifra mencionada en la publicación de Ben), se obtiene un recipiente con paredes de acero de 23 pulgadas, ignorando nuevamente la práctica de ingeniería y la resistencia frente a la temperatura.

La conclusión es que este no es un proyecto trivial y puede tener algunas consecuencias bastante novedosas. Es casi seguro que los recursos que tendrían que dedicarse a él se gastarían mejor en otras direcciones.

Por cierto, en este punto no comparto la confianza de Bob Ettinger de que el agrietamiento no es un problema para la criostasis del nitrógeno líquido. Aunque de hecho puede resultar que tenga razón, todavía queda trabajo por hacer en esta área antes de que podamos llegar a esa conclusión (trabajo que todavía está en progreso aquí en Alcor).

(volver a contenidos)

VI. RESPUESTA DE BEN BEST

Reproduzco aquí un gráfico de la capacidad calorífica del hielo. La capacidad calorífica se define como la cantidad de calor requerida para elevar una cantidad de material, típicamente un mol, un grado (K o ºC) a presión constante (C _p ) o volumen constante (C _v ). El gráfico muestra _Cp en julios/mol-K. Las cifras de Hugh son para la cantidad de calor por gramo de material, más a menudo llamado calor específico .

Ahora discierno tres usos potenciales de la presión en la criónica:

1. Aplicación rápida de presión para forzar la vitrificación
2. Presión para reducir la toxicidad de los crioprotectores
3. La presión como complemento de los crioprotectores en la vitrificación

Discutiré cada uno de estos usos a su vez:

(1)   Aplicación rápida de presión para forzar la vitrificación
(Para obtener detalles sobre la tecnología de vitrificación, consulte mi ensayo Vitrification in Cryonics ).

Los líquidos se pueden vitrificar mediante un enfriamiento rápido (con o sin crioprotectores o formadores de red) o mediante la aplicación de presión. A presión atmosférica, el selenio se derrite a 220 ºC, pero a 40 ºC y 11 kilobares (alrededor de 11 000 atmósferas de presión), el selenio muestra una presión de transición vítrea ( P _g ) en la que hay una disminución del 40 % en la compresibilidad y un cambio similar en la expansividad térmica, que deja el selenio en un estado vitrificado (vidrio).

A diferencia de (2) y (3), que se basan en que el hielo es menos denso que el agua, este método (la idea del crionicista alemán) supone la formación de una solución de vitrificación que es más densa que el agua. Hugh Hixon pierde por completo el punto cuando se refiere a "cristales de hielo formados a alta presión". El objetivo de este procedimiento es aplicar presión tan rápidamente que la solución no tenga tiempo de formar cristales de hielo. Además, un sólido vitrificado de tejido podría formarse de esta manera sin necesidad de crioprotector (y sin toxicidad). Sin embargo, esto requiere presiones del orden de las 14.000 atmósferas, lo que podría ser un desafío técnico, como señala Hugh Hixon.

Además, a pesar de que se forma un sólido vítreo (en lugar de hielo), creo que Hugh tiene un muy buen punto sobre el estado metaestable, un factor que no había considerado. El sólido vitrificado sería potencialmente "explosivo" debido a su alta densidad y, sin embargo, frágil y vulnerable al agrietamiento (al igual que el vidrio). Posiblemente las fuerzas cohesivas podrían superar adecuadamente a las fuerzas explosivas, y no habría problema. Como se señaló anteriormente, al menos algunos hielos de alta presión pueden enfriarse a la temperatura del nitrógeno líquido y despresurizarse sin incidentes. Un material vítreo presurizado puede ser igual de seguro. Psicológicamente, es difícil pensar en términos de un bajo grado de "explosividad", pero creo que esta puede ser la situación. De lo contrario, sería necesario mantener la presión. Como el sólido es súper denso, podría mantener la inercia de un sólido almacenado en nitrógeno líquido a temperaturas más altas. Pero el nitrógeno líquido probablemente sería el medio de enfriamiento más económico.

También debo reconocer que las altas presiones extremas requeridas para esta técnica están destinadas a causar daños en los tejidos y provocar la pérdida de viabilidad. La compresibilidad diferencial de las sustancias tisulares y los cambios conformacionales con algunas enzimas y proteínas son inevitables. No obstante, creo que el daño estructural aún sería considerablemente menor que el daño debido a la toxicidad de los crioprotectores y el daño por congelamiento. No obstante, la cuantificación y comparación de este daño debe intentarse experimentalmente, no simplemente sobre la base de la especulación.

(2)   Presión para reducir la toxicidad de los crioprotectores

Si se puede reducir el punto de congelación, el crioprotector se puede introducir a una temperatura más baja con el tejido aún líquido, pero con el crioprotector menos tóxico. Esto podría ser de particular beneficio para el DMSO ya que es mucho menos tóxico a baja temperatura y perfunde las células mucho mejor que el glicerol. Me gustaría ver trabajo en esto, de hecho, este era el trabajo que esperaba que hiciera el Dr. Greg Fahy. Pero él no tenía ningún interés en esto. Introdujo crioprotector cerca de los 0ºC y luego presión aplicada. Descubrió que las presiones superiores a 500 atmósferas reducían la viabilidad (al desnaturalizar las proteínas). Debido a que 500 atmósferas solo reducen el punto de congelación en unos 5 ºC, no creía que valiera la pena el esfuerzo. Sin duda, también es técnicamente más difícil introducir crioprotectores a alta presión que introducir crioprotectores y luego aplicar presión. Dado que el Dr. Fahy estaba logrando tanto éxito con su cóctel crioprotector, no sorprende que perdiera interés en los métodos de alta presión (técnicamente difíciles).

(3)  Presión como complemento de los crioprotectores en la vitrificación

Dado que el hielo es menos denso que el agua, la aplicación de presión durante el enfriamiento puede inhibir la formación de hielo. Como se mencionó, este es el enfoque con el que evidentemente experimentó el Dr. Fahy. Los beneficios de este enfoque no justificaron los costos para él, especialmente dados los frutos que estaba viendo con la mejora del cóctel crioprotector y el protocolo de recalentamiento. Si esto es cierto, estaría de acuerdo con Hugh Hixon (y Brian Wowk) en que "los recursos que tendrían que dedicarse a [métodos de alta presión] seguramente se gastarían mejor en otras direcciones".

No creo que el daño mecánico del tejido sea el problema crucial con la criónica de muy alta presión, aunque es probable la desnaturalización de proteínas y el daño debido a la compresión diferencial. Creo que los problemas clave que necesitan investigación son el calor de fusión y el desarrollo de equipos manejables a un costo razonable. Si el dinero para la investigación fuera ilimitado, me gustaría ver las técnicas de alta presión (y muchas otras técnicas) estudiadas a fondo. Tal como están las cosas, la investigación de crioprotectores todavía parece ser el programa de investigación más rentable para los crionicistas debido a los altos costos del equipo y las dificultades técnicas que plantea el equipo. (Consulte Un resumen de los primeros seminarios de 21CM y El proyecto de criopreservación de cortes de hipocampo ).

(volver a contenidos)

VIII. COMENTARIOS DE UN CRIOBIÓLOGO

Un criobiólogo hizo el siguiente comentario con respecto a parte del material anterior:

que no sólo es perjudicial en sí mismo, sino que también permite el crecimiento de hielo extracelular en la célula, desmenuzando de nuevo la célula. Finalmente, no hay evidencia de que el incremento de volumen del 9% asociado con la congelación tenga algo que ver con el daño por congelación, a pesar de la gran cantidad de especulaciones mal informadas".

(volver a contenidos)

VIII. BEN MEJORES RESPUESTAS

El argumento del incremento de volumen del 9% es una verdad a medias, en el mejor de los casos (más probablemente, una verdad a la décima parte). El agua líquida tiene una densidad de 1.000 y el hielo tiene una densidad de 0.9168, por lo tanto el hielo ocupa un volumen (1.000/0.9168)x100 = 109.08% — 9% mayor que el agua. Pues claro, queremos vitrificar, no formar hielo .. Sí, es cierto que si se pierde demasiada agua de las células, se perderá la viabilidad debido al entrecruzamiento de las proteínas dentro de las células. Pero enfatizar el número "9%" deja la implicación de que una pérdida de agua del 10% dará como resultado la pérdida de viabilidad debido a la reticulación. El argumento implica encubiertamente una precisión requerida por el proceso de vitrificación que sería difícil de lograr. Pero ya sabemos que los hámsteres dorados pueden perder mucho más que esto de sus neuronas, ya que experimentan una recuperación neurológica tras una congelación del 60% del agua de su cerebro.

La crítica de la idea central del crionicista alemán, sin embargo, me inspira a creer que es incluso más plausible de lo que pensaba anteriormente. Uno de los principales problemas que vi con su idea fue mi concepción de que la aplicación rápida de presión para forzar la vitrificación conduciría a un aumento de temperatura de 60 ºC debido al calor de fusión. Pero la vitrificación no implica calor de fusión. Y gran parte del calentamiento adiabático se puede evitar mediante la aplicación gradual de presión (inicialmente, al menos) junto con enfriamiento externo. Este proceso podría llevar primero la muestra a -22ºC y 2000 atmósferas, porque esta temperatura y presión aumentarían la viscosidad y, por lo tanto, inhibirían la nucleación.

Si el enfriamiento rápido provoca la vitrificación, me parece plausible que la aplicación rápida de presión pueda hacer lo mismo, por encima de la Tg (Tg = temperatura de transición, es decir, la temperatura de vitrificación para una solución crioprotectora) para un enfriamiento rápido sin presión. Dado que Tg es una función de la tasa de enfriamiento, no hay razón por la que no pueda ser también una función de la tasa de aplicación de presión, o alguna combinación de las dos (más el crioprotector). Se sabe que la presión distorsiona la red de hielo I de su orientación tetraédrica ideal, y esto podría ser importante para prevenir la nucleación. No puedo decir qué tasa de aplicación de presión sería necesaria, ni cuánto la presión sería necesaria para la vitrificación, pero probablemente sería menor que mi suposición original.

Mi idea detrás de las 14.000 atmósferas estuvo totalmente motivada por la idea del calor de fusión. Pero mi intuición física me dice que la aplicación extremadamente rápida de presión daría como resultado la vitrificación al amontonar las moléculas de agua tan rápidamente que no tendrían tiempo de nuclearse. El hecho de que Tg esté tan por debajo del punto de congelación en una atmósfera se basa en el concepto de vitrificación por enfriamiento rápido en lugar de la aplicación rápida de alta presión. Los diagramas de fase PVT no son mejores para indicar el potencial de vitrificación por enfriamiento rápido que para indicar el potencial por aplicación rápida de presión. _{El H 2} O sólido amorfo de alta densidad es ligeramente más denso que el agua líquida.

La ventaja potencial de la vitrificación por aplicación de presión rápida sobre la vitrificación por enfriamiento rápido es que la presión puede propagarse inmediatamente al centro de la muestra, mientras que el cambio de temperatura debe difundirse lentamente hacia el interior. La rapidez del proceso podría incluso no dejar tiempo suficiente para la desnaturalización de la enzima. La desventaja es el posible daño estructural debido a la compresibilidad diferencial bajo alta presión ( nodebido al hielo nucleado en las celdas, que no se formaría en condiciones de vitrificación inducida por presión rápida) y el costo probable del equipo necesario. Aunque los costos probablemente sean sustanciales, no creo que sean comparables a los de poner en órbita a un crionicista. Pero dado que parece que los métodos más baratos son tan prometedores, probablemente haya pocas razones para preocuparse por el costo y el daño potencial de las técnicas de alta presión.

(volver a contenidos)

IX. ALIMENTOS PRESURIZADOS Y CONGELADOS PARA EL PENSAMIENTO DE IGOR ARTYUHOVO

(Reimpreso con permiso de CRYONET : el resumen del servidor de listas para crionicistas iniciado y administrado por Kevin Brown. Específicamente, este era el mensaje CryoMessage #21732 , aunque Douglas Skrecky me dio crédito por referencias por error).

Ambos artículos [1, 2] mencionados por Douglas Skrecky en CryoMessage #17788 me parecen de gran interés para los crionicistas.

De hecho, el método, ahora conocido como High-Pressure Shift Freezing fue (AFAIK) aplicado experimentalmente por primera vez en 1967 por Maxim Persidsky en un intento de preservar un riñón canino [3,4]. Los riñones mostraban menos signos de deterioro del tejido que los riñones congelados por cualquier otro método, pero aun así no eran viables. No conozco ningún intento posterior en esta dirección.

Más tarde, el método se reinventó con el nombre de HPSF para lograr una conservación de alimentos de alta calidad. Hoy el área está bajo una exploración bastante extensa; el resultado se presenta principalmente en "Journal of Food Sciences" y "Food Technology" (ver lista de referencias en [1]).

La idea principal del método proviene del hecho de que, aplicando suficiente presión al agua, podemos reducir su temperatura de fusión ( T _m ). A una presión de 210 MPa (~2100 atm) T _m es −22ºC; un mayor aumento de la presión da como resultado un aumento de T _m . Fue mencionado dos o tres veces en CryoMessage #5077 et al.)

Es poco práctico almacenar alimentos o cuerpos humanos a 2100 atm; además, −22ºC está lejos de las temperaturas de interés para los crionicistas. Pero la buena noticia es que cuando se libera la presión, y eso se puede hacer muy rápidamente, el agua de la muestra se sobreenfría a -22 ºC a presión atmosférica.

En ausencia de crioprotectores y bloqueadores de hielo, pronto, en unos pocos segundos, se convertirá en hielo. Pero los cristales serán

1. Muy pequeño
2. De forma granular (vs. en forma de aguja, cuando se enfría desde la superficie)
3. Distribuido uniformemente por toda la muestra.

Por lo tanto, el daño de los cristales de hielo será mucho menor que en el caso del enfriamiento de la superficie.

No toda el agua se congelará. Dado que la congelación produce mucho calor, la muestra se calentará a 0ºC cuando alrededor del 29% se transforme en hielo [1]**. Entonces, HPSF solo no es suficiente para la criónica.

Se pueden aplicar varios métodos para manejar el 71% restante del agua:

Uso de crioprotectores. De hecho, la aplicación de presión puede reducir la concentración necesaria de crioprotector en un 0,29, por ejemplo, del 27 % al 19 %.

Congelación cíclica. Persidsky [3, 4] usó una combinación de crioprotector (15% DMSO) y varios ciclos de compresión, enfriamiento y liberación.

Superenfriamiento. La temperatura de nucleación homogénea (la temperatura máxima a la que se puede sobreenfriar el agua) desciende de -40 ºC a presión atmosférica a -90 ºC a 2100 atm [5]. Entonces, en teoría, el agua se puede enfriar hasta -90ºC sin cristalizar. En este caso el calor de transición de fase no será suficiente para calentar el agua a 0ºC y todo se convertirá en hielo inmediatamente después de la liberación de la presión. El uso de crioprotectores y bloqueadores de hielo puede ayudar a lograr el grado necesario de sobreenfriamiento.

Por supuesto, cualquier combinación de estos métodos es posible.

Otra posibilidad es utilizar la vitrificación en lugar de la congelación. A alta presión, la viscosidad del agua aumenta considerablemente, hasta 1500 veces a 2100 atm [5], lo que reduce en gran medida la tasa de nucleación. El método de alta presión permite vitrificar muestras de hasta 0,2 mm de espesor con un volumen total de ~1 mm ³ sin crioprotectores a una velocidad de enfriamiento de 200 ºC/seg (frente a 10000 ºC/seg a presión atmosférica) [5]. Y, como en el caso del sobreenfriamiento, los crioprotectores y los bloqueadores de hielo pueden ayudar. También se puede usar alta presión en la etapa de descongelación para reducir la recristalización.

La mala noticia es que la aplicación de presiones de 2000 atm conduce a la desnaturalización de algunas proteínas [6]. Es difícil decir ahora si este tipo de daño es inapropiado para fines de criónica, en comparación con la cristalización, el choque osmótico, el agrietamiento, etc. Es posible que más ciclos de compresión, enfriamiento y liberación con, digamos, 1000 o 500 atm de presión sirva mejor.

Por supuesto, la cámara de 2100 atm para todo el cuerpo será un equipo bastante caro. Pero, si ellos pueden permitírselo para el procesamiento de alimentos, ¿no podemos permitírnoslo nosotros mismos?

__________________________
** De hecho, se debe considerar la capacidad térmica total de la muestra/cuerpo en lugar de solo la capacidad del agua. Por lo que puede hacer falta mucho más del 29% de agua en cristalizar para calentar todo el tejido a 0ºC.

REFERENCIAS

• 1. L. Otero, PD Sanz, "Congelación por desplazamiento a alta presión. Parte 1. Cantidad de hielo formado instantáneamente en el proceso", Biotechnology Progress, 16(6):1030-6, 2000 Nov-Dic.
• 2. PD Santz, L. Otero, "Congelación por desplazamiento a alta presión. Parte 2. Modelado de tiempos de congelación para un modelo cilíndrico finito", Biotechnology Progress. 16(6):1037-43, 2000 noviembre-diciembre.
• 3. MD Persidsky, V. Richards, "Crioconservación de órganos en ausencia de gradientes térmicos", Criobiología, marzo-abril de 1967, págs. 375-376.
• 4. MD Persidsky et al., "Dog Kidney Cryopreservation Under Thermal Gradient-Free Conditions", Cryobiology, marzo-abril de 1968, págs. 264-265.
• 5. "Máquina de congelación de alta presión HPM 010"

También olvidé mencionar la biotecnología de alta presión en medicina y ciencia farmacéutica de Patrick Masson, Carole Tonello y Claude Balny ( Journal of Biomedicine and Biotechnology, 1:2 (2001), pp. 85-88 ). Ya publiqué su resumen en CryoMessage #18392, el documento presenta una buena encuesta sobre los efectos de la alta presión en la materia viva y la desnaturalización de las proteínas, etc. Agréguelo a la lista de referencias como [6].

(volver a contenidos)

X. MEJORES RESPUESTAS DE BEN

Usted dice que no sabe de intentos posteriores en la dirección de usar presión para crioconservar riñones, pero el Dr. Gregory M. Fahy en realidad siguió esta ruta. Su solución de vitrificación superior original se trabajó solo a alta presión; la llamó VS4  (Solución de vitrificación 4). Sin embargo, luego desarrolló VS4-1A , llamado así porque funcionaba bien a una atmósfera de presión. Desde entonces, ha seguido desarrollando crioprotectores cada vez mejores que no requieren alta presión para funcionar, por lo que ha abandonado los métodos de alta presión en 21st Century Medicine (21CM) .

El Dr. Fahy realmente patentó esta idea en 1985. Es la Patente 4,559,298 . Curiosamente, descubrió que algunos crioprotectores también actúan como baroprotectores . Específicamente, el tejido renal se dañó a 685 atm de presión, pero no se dañó a 1030 atm cuando se trató con 30 % de DMSO o 30 % (DMSO+propilenglicol).

Su mejor procedimiento fue equilibrar lentamente el sistema biológico con solución de vitrificación a temperaturas cercanas a los 0ºC y luego aumentar repentinamente la concentración al 35%-50% (la concentración necesaria para vitrificar). Después de un tiempo más, el sistema se colocó en una cámara de alta presión y la presión subió rápidamente a 500-2000 atm y la temperatura se bajó lo más rápido posible a -130ºC. Luego, la presión se libera lentamente y el enfriamiento adicional es muy lento (menos de 0,5 grados C/minuto hasta una temperatura de almacenamiento final de -150 °C a -200 °C con algo de "recocido" a -140 °C. Su solución crioprotectora óptima en ese momento era una mezcla de 17,5% DMSO, 17,5% propilenglicol y 6% PVP (polivinilpirrolidona).

Tenga en cuenta que este enfoque utiliza presión para ayudar a los crioprotectores, en contraste con el uso de una presión increíblemente alta aplicada con extrema rapidez a un sistema ya presurizado sugerido por el crionicista alemán, sin ningún uso de crioprotectores. Tenga en cuenta también que los métodos de presión de algún tipo aún pueden encontrar aplicación si solo se necesita una pequeña cantidad de asistencia adicional para ayudar a algún crioprotector en la crioconservación de algún tejido.

Read more »